[發明專利]一種用于食品保鮮的雜合肽及其在釀酒酵母表達系統的基因表達方法

有效

• 申請號: 202110336260.6
• 申請日: 2021-03-29
• 公開（公告）號: CN113135997B
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發明（設計）人: 魏建超;馬志永;李宗杰;管志欣;李蓓蓓;邱亞峰;劉珂;邵東華
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院上海獸醫研究所（中國動物衛生與流行病學中心上海分中心）
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/81;C12N15/66;C12N15/64;C12P21/02;A23B4/20;A23C3/08;C12R1/865
• 代理公司: 臺州浙粵壟專利代理事務所(普通合伙) 33419
• 代理人: 王洪臣

本發明提供了一種用于食品保鮮的雜合肽及其在釀酒酵母表達系統的基因表達方法，屬于功能多肽篩選技術領域。為了克服現有技術的不足，本發明提供一種用于食品保鮮的雜合肽及其在釀酒酵母表達系統的基因表達方法，該雜合肽融合了豬源抗菌肽cecropin P1的活性區域和牛源抗菌肽的活性區域的優勢獲得新型的雜合肽，通過人工合成雜合肽基因并將目的基因連接在質粒pYES2?ɑ上獲得新型雜合肽重組酵母菌株，使用半乳糖誘導其表達，上清液進一步純化后即可用于食品保鮮，尤其對于新鮮豬肉保鮮和牛奶保鮮具有很好的效果。

技術領域

本發明屬于功能多肽篩選技術領域，涉及一種一種用于食品保鮮的雜合肽及其在釀酒酵母表達系統的基因表達方法。

背景技術

隨著人們生活水平的提高，消費需求和方式的轉變，生鮮食品已成為城鄉居民生活中的必需品。但由于保鮮技術的相對滯后，生鮮食品產后容易腐敗變質，成為制約我國農產品加工業和食品工業發展的重要因素之一。生鮮食品保鮮已成為當今農業、食品企業、物流業和消費者所關心的熱點問題。多重耐藥性超級細菌的頻繁出現，讓人們意識到濫用抗生素造成的藥物殘留以及環境污染等問題的嚴重性。近年來，生物保鮮技術由于其環保且不會產生耐藥性越來越受到青睞。

生物保鮮技術是將某些具有抑菌或殺菌活性的天然物質配制成適當濃度的溶液，通過浸泡噴淋或涂膜等方式應用于生鮮食品中，進而達到防腐保鮮的效果。生物保鮮技術的機理包括抑制或殺滅食品中的微生物，隔離食品與空氣的接觸，延緩氧化作用，調節貯藏環境的氣體組成及相對濕度等因生物保鮮劑具有天然、安全、簡便等優點，故應用范圍不斷擴大，已成為食品保鮮技術的研究熱點之一。

目前生物保鮮方面研究較多的是利用微生物菌體及其代謝產物保鮮、生物天然提取物保鮮和基因工程技術保鮮。抗菌肽是具有抗微生物活性的小分子多肽，其產生于抗致病菌的防御反應過程中。由于抗菌肽來源廣，相對分子質量小，且具有強陽離子性、良好的熱穩定性、酸堿穩定性和蛋白酶穩定性以及較為廣泛的抑菌譜，因此使用綠色、穩定、安全、小分子的抗菌肽代替抗生素用于生物保鮮以及抑菌防腐已成近年來研究的熱點。

抗菌肽cecropin P1是1989年Lee等首先從豬小腸分離得到的，后來研究表明，其實際上來源于豬腸道內的蛔蟲。由31個氨基酸組成，分子量為3.3KDa。二級結構為：ɑ-螺旋，N端為強堿性，C端為強疏水性，且中間可形成柔性彎曲的谷氨酸－甘氨酸(Glu-Gly)卷曲序列，其螺旋－卷曲－螺旋結構對抗菌活性具有特殊的重要性。牛源抗菌肽BMAP-27和BMAP-28分別由27和28個氨基酸，在C末端分別包含一個抗菌活性的ɑ-螺旋結構域，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有良好的抗菌活性。但目前抗菌肽cecropin P1還存在抑菌活性不強以及溶血性較高的特點，如何最大程度上發揮或增強抗菌肽的抑菌活性并降低其細胞毒性成為抗菌肽的研究的焦點所在。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明提供一種用于食品保鮮的雜合肽及其在釀酒酵母表達系統的基因表達方法，該雜合肽融合了豬源抗菌肽cecropin P1的活性區域和牛源抗菌肽的活性區域的優勢獲得新型的雜合肽，通過人工合成雜合肽基因并將目的基因連接在質粒pYES2-ɑ上獲得新型雜合肽重組酵母菌株，使用半乳糖誘導其表達，上清液進一步純化后即可用于食品保鮮，尤其對于新鮮豬肉保鮮和牛奶保鮮具有很好的效果。

本發明的目的之一是提供一種用于食品保鮮的雜合肽，該雜合肽包含33個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ.No1所示。該雜合肽的抗菌效果好，且細胞毒性低，提高其抗菌效果，降低其細胞毒性。

用于編碼上述雜合肽的核苷酸序列如SEQ：No.2所示；其上游引物如SEQ：No.3所示；其下游引物如SEQ：No.4所示；

本發明還提供一種上述雜合肽在釀酒酵母表達系統的基因表達方法，其具體包括如下步驟：

1)人工合成雜合肽的基因序列，將雜合肽基因進行PCR擴增后使用連接酶將其連入重組酵母表達載體pYES2-ɑ中，構建表達重組質粒pYES2-ɑ-SS-33；