[發明專利]一種綠色熒光蛋白替換Fiber-2的重組血清4型禽腺病毒及其制備方法

在審

• 申請號: 202110332457.2
• 申請日: 2021-03-29
• 公開（公告）號: CN113005102A
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 葉建強;謝泉;穆雅茹;秦愛建;邵紅霞;萬志敏;李拓凡
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N7/04;C12N15/85;C12N15/65;C12N15/55;C12N15/34;C12R1/93
• 代理公司: 揚州蘇中專利事務所(普通合伙) 32222
• 代理人: 沈志海

本發明涉及一種綠色熒光蛋白替換Fiber?2的重組血清4型禽腺病毒及其制備方法，本發明利用當下流行的血清4型禽腺病毒作為載體，將病毒的毒力基因之一F2進行刪除，純化后成功獲得了表達EGFP的F2完全缺失的重組FAdV4病毒，在體內及體外實驗結果均顯示，FAV4?EGFP?rF2重組病毒毒力顯著降低，且攻毒后保護率很好，由此可見，本發明提供的F2完全缺失型重組病毒不僅能夠為FAdV?4的防控提供生物材料，同時EGFP替換F2的位置可以作為插入其他病原保護性抗原的插入位點，為構建FAdV?4重組多價苗提供了堅實的理論依據。

技術領域

本發明涉及一種綠色熒光蛋白替換Fiber-2的重組血清4型禽腺病毒及其制備方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)屬于腺病毒科禽腺病毒屬，分為5個種(A-E)，12個血清型。雖然在世界各地均有報道，FAdV感染一般引起亞臨床狀況，而急性感染主要引起包涵體肝炎、心包積液以及肌胃糜爛等。自2013年，國內雞群由FAdV引起的包涵體肝炎、心包積液病例逐漸增多。到2015年，FAdV感染在國內多個省份雞群爆發。目前FAdV爆發不僅發生在3-4周齡肉雞，還發生于10-20周齡的蛋雞，給國內養雞業造成了嚴重經濟損失。病毒分離鑒定發現，目前高致病性4型FAdV在國內雞群流行較廣泛。然目前尚無FAdV-4的疫苗。此前有報道五鄰體、六鄰體、纖突蛋白F1和纖突蛋白F2等亞單位疫苗均能夠提供一定的保護率，考慮到亞單位疫苗的保護率不如全病毒滅活苗，而全病毒滅活苗的制備成本較高，且不能激活機體的細胞免疫。因此，考慮本發明的亮點是將禽腺病毒的毒力基因刪除，獲得高度致弱的禽腺病毒，作為一種弱毒疫苗，能夠同時激活機體的體液免疫和細胞免疫，達到很好的保護力。與此同時，F2基因刪除的位置也可以考慮作為外源基因的插入位點，從而插入外源基因，構建二價苗，甚至多價苗。

CRISPR-Cas9技術作為古細菌的免疫系統，近年來得到了快速的發展和應用，從真核生物到原核生物，從病毒到真菌，被廣泛應用于各個方面。本發明利用CRISPR-Cas9技術對禽腺病毒進行編輯，通過同源重組修復，獲得F2完全缺失的重組血清4型禽腺病毒，為禽腺病毒的防控打下堅實的理論基礎。

發明內容

本發明的目的在于針對上述問題，提供一種綠色熒光蛋白替換Fiber-2的重組血清4型禽腺病毒及其制備方法，可供插入其他病原保護性抗原的位點。本發明的原理和最核心的關鍵技術是通過CRISPR-Cas9技術將毒力基因F2刪除，并用標簽蛋白EGFP替換。隨后利用EGFP進行病毒純化，獲得可以穩定擴增的重組禽腺病毒。

本發明的目的是這樣實現的，一種綠色熒光蛋白替換Fiber-2的重組血清4型禽腺病毒，其特征在于，其載體為野生型血清4型禽腺病毒SD株；

所述重組血清4型禽腺病毒的外源基因為增強型綠色熒光蛋白EGFP，在激發光的照射下發出綠色熒光，作為插入位點的熒光標簽分子，其序列如SEQ ID NO.1所示；

SEQ ID NO.1為：