[發明專利]一種同時檢測多種DNA糖基化酶的熒光化學傳感器及其檢測方法和應用

有效

• 申請號: 202110332327.9
• 申請日: 2021-03-29
• 公開（公告）號: CN113088557B
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發明（設計）人: 張春陽;張艷;胡金萍
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12Q1/34
• 分類號: C12Q1/34;C12Q1/682
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 王志坤

1.檢測一種或兩種DNA糖基化酶的熒光化學傳感器，其特征在于，所述熒光化學傳感器包括雙鏈DNA底物、報告探針、酶、緩沖液和dNTPs；

所述雙鏈DNA底物包括用于識別兩種DNA糖基化酶識別序列，雙鏈DNA底物兩條鏈的5'末端分別修飾熒光淬滅基團，所述報告探針被熒光基團修飾，所述熒光淬滅基團連接的堿基序列與報告探針雜交形成堿基對；

所述雙鏈DNA底物中，其中一條鏈中具有用于識別一種DNA糖基化酶識別序列，另一條鏈上具有識別另一種DNA糖基化酶識別序列；

所述DNA糖基化酶包括UDG和hAAG；

當所述DNA糖基化酶為UDG時，DNA糖基化酶識別序列為5'-BHQ1-GCT CGT CAC TGT CCTAGC AGT GAG ATA GAG CTC TGA GAA TCT ACG TAC UTC CA-NH₂-3'，U代表脫氧尿嘧啶；

當所述DNA糖基化酶為hAAG時，DNA糖基化酶識別序列為5'-BHQ2-GTG CAC TCG ATCGCA GGC AGT GAG CAA TGG AAG TAC GTA GAT TCT CAG IGC TC-NH₂-3'，I代表次黃嘌呤；

所述雙鏈DNA底物3'末端修飾NH₂；

所述雙鏈DNA底物5'末端分別修飾BHQ1和BHQ2淬滅基團；

所述熒光基團包括Cy3和Cy5，Cy3標記的報告探針和Cy5標記的報告探針分別與連有BHQ1和BHQ2淬滅基團的堿基序列雜交形成堿基對，BHQ1與Cy3鄰近，BHQ2與Cy5鄰近；

Cy3標記的報告探針的堿基序列為ACA GTG ACG AGC-Cy3；

Cy5標記的報告探針的堿基序列為GAT CGA GTG CAC-Cy5；

所述酶包括脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶、Nb.BtsI切刻酶和Klenow片段DNA聚合酶。

2.根據權利要求1所述的檢測一種或兩種DNA糖基化酶的熒光化學傳感器，其特征在于，所述UDG識別序列和hAAG識別序列位于雙鏈DNA底物的不同鏈上。

3.權利要求1-2任一項所述檢測一種或兩種DNA糖基化酶的熒光化學傳感器的制備方法，其特征在于，包括：

將一種DNA糖基化酶識別序列和另一種DNA糖基化酶識別序列，與被熒光基團修飾的報告探針在緩沖液中加熱進行反應，冷卻后形成同時檢測兩種DNA糖基化酶的熒光化學傳感器；

所述每種DNA糖基化酶識別序列和被熒光基團修飾的報告探針濃度為10μM/L；

所述加熱溫度為80-100℃，保溫5-10分鐘。

4.根據權利要求3所述的檢測一種或兩種DNA糖基化酶的熒光化學傳感器的制備方法，其特征在于，所述加熱溫度為95℃，所述保溫5分鐘。

5.權利要求1-2任一項所述檢測一種或兩種DNA糖基化酶的熒光化學傳感器在非疾病診斷目的的DNA糖基化酶檢測中的應用；

所述DNA糖基化酶至少為兩個；

所述DNA糖基化酶包括UDG和hAAG。

6.一種非疾病診斷目的的檢測一種或兩種DNA糖基化酶的方法，其特征在于，所述方法包括：

1）將待測樣品和權利要求1-2任一項所述檢測一種或兩種DNA糖基化酶的熒光化學傳感器混合反應；

2）將步驟1）產物加入脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶、DNA聚合酶、dNTPs、Nb.BtsI切刻酶，進行反應。

7.如權利要求6所述非疾病診斷目的的檢測一種或兩種DNA糖基化酶的方法，其特征在于，所述檢測方法還包括采用熒光檢測系統測定熒光信號，從而實現對DNA糖基化酶的定量檢測。