[發(fā)明專利]一種用于敲低人CBS基因的載體、制劑及其制備方法和應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110329136.7
• 申請(qǐng)日: 2021-03-27
• 公開（公告）號(hào): CN112980845A
• 公開（公告）日: 2021-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳東棟;李見梅;王迪;祁慧雯;王怡禛;敬米蓉;張艷霞;蔡春波;李彥章;姬新穎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/85;C12N15/66;C12N15/60;A61K48/00;A61K31/713;A61P35/00
• 代理公司: 西安合創(chuàng)非凡知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 61248
• 代理人: 馬英

本發(fā)明公開了一種用于敲低人CBS基因的載體、制劑及其制備方法和應(yīng)用，涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，所述載體的制備方法包括：依據(jù)人CBS基因序列，設(shè)計(jì)引物，用于PCR擴(kuò)增目的基因，具體序列見SEQ ID NO.1；對(duì)GV102載體中的限制性酶切位點(diǎn)BamH I和HindⅢ進(jìn)行酶切，形成線性化GV102載體，所述GV102載體順序?yàn)椋篽U6?MCS?CMV?GFP?SV40?Neomycin；將上兩步的產(chǎn)物進(jìn)行連接構(gòu)建GV102?CBS載體。本發(fā)明制備的載體能夠顯著抑制人CBS基因的表達(dá)，達(dá)到抑制人甲狀腺癌細(xì)胞增長(zhǎng)、降低癌細(xì)胞遷移率的目的，可用于制備治療人甲狀腺癌的制劑之中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物制藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于敲低人CBS基因的載體、制劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

甲狀腺癌（thyroid carcinoma）是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，屬于甲狀腺上皮的腫瘤，它包括四種病理類型，分別是乳頭狀癌、濾泡狀癌、未分化癌和髓樣癌。除髓樣癌外，大約90%的甲狀腺癌起源于濾泡上皮細(xì)胞。乳頭狀癌為最常見的惡性程度較低、預(yù)后較好的一種甲狀腺癌。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于甲狀腺癌治療的手段主要包括外科手術(shù)、促甲狀腺素抑制治療、生物治療和中藥治療。但是還沒有通過制備敲低胱硫醚β合成酶(CBS)基因的相關(guān)藥物來治療甲狀腺癌的報(bào)道。

胱硫醚β合成酶(CBS)是一種細(xì)胞質(zhì)中的同源四聚體，由63KD的亞基組成，是一種磷酸吡哆醛(pyridoxalphosphate,PLP)依賴性酶。人類CBS基因編碼一種551個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，由四個(gè)63-kDa亞基組成的人CBS活性形式。每個(gè)亞單位由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，N端結(jié)構(gòu)域與輔因子血紅素結(jié)合，這是蛋白質(zhì)成功折疊和組裝所必需的。催化結(jié)構(gòu)域包含另一種輔因子PLP 的結(jié)合位點(diǎn)。碳末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域包含兩個(gè)CBS基序(CBS1和CBS2)，它們二聚形成貝特曼結(jié)構(gòu)域。這個(gè)域名負(fù)責(zé)亞單位四聚化并含有變構(gòu)激活劑S-腺苷甲硫氨酸的結(jié)合位點(diǎn)。在天然的四元結(jié)構(gòu)中，底物進(jìn)入催化核心的途徑被碳末端調(diào)節(jié)基序封閉，SAM的結(jié)合誘導(dǎo)構(gòu)象變化，從而改善底物進(jìn)入催化位點(diǎn)的途徑。CBS參與了有助于內(nèi)源性硫化氫(H₂S)產(chǎn)生的脫硫反應(yīng)。CBS主要通過控制半胱氨酸（Hcy）和H₂S代謝發(fā)揮多種生物學(xué)功能，包括線粒體生物能學(xué)、氧化還原穩(wěn)態(tài)、DNA 甲基化和蛋白質(zhì)修飾。CBS 的去調(diào)控和相關(guān)的Hcy 和/或H₂S水平的改變導(dǎo)致心血管、免疫和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的廣泛病理紊亂，并導(dǎo)致疾病的發(fā)展。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種用于敲低人CBS基因的shRNA，所述shRNA的具體序列見SEQ ID NO.1。

本發(fā)明還提供一種用于敲低人CBS基因的載體，所述載體包含本發(fā)明所述shRNA。

本發(fā)明還提供一種用于敲低人CBS基因的載體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1：依據(jù)人CBS基因序列，設(shè)計(jì)引物，用于PCR擴(kuò)增目的基因，具體序列見SEQ IDNO.1；

具體序列如下：CAAGGTCGGGCAGGAAGAG,TAATACGACTCACTATAGGG

S2：對(duì)GV102載體中的限制性酶切位點(diǎn)BamH I和Hind Ⅲ進(jìn)行酶切，形成線性化GV102載體，所述GV102載體順序?yàn)椋篽U6-MCS-CMV-GFP-SV40-Neomycin；

S3：將步驟S1和步驟S2的產(chǎn)物進(jìn)行連接構(gòu)建GV102-CBS載體。

本發(fā)明還提供一種用于敲低人CBS基因的制劑，所述制劑含有本發(fā)明所述載體。

本發(fā)明還提供一種本發(fā)明所述載體在制備治療人甲狀腺癌的制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明制備的載體能夠顯著抑制人CBS基因的表達(dá)，達(dá)到抑制人甲狀腺癌細(xì)胞增長(zhǎng)、降低癌細(xì)胞遷移率的目的，可用于制備治療人甲狀腺癌的制劑之中。