[發明專利]一種多層三維數字核酸擴增芯片及其制作與使用方法

在審

• 申請號: 202110327830.5
• 申請日: 2021-03-26
• 公開（公告）號: CN112920941A
• 公開（公告）日: 2021-06-08
• 發明（設計）人: 羅春雄;榮楠
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;C12M1/38;C12M1/00;C12Q1/686;C12Q1/6844
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 張璐

本發明涉及數字PCR領域，具體涉及一種多層三維數字核酸擴增芯片及其制作與使用方法。本發明的多層三維數字核酸擴增芯片中，可實現對微陣列芯片的多層疊加，大幅增加數字核酸擴增的反應單元數目，使得核酸定量的動態范圍和檢測下限精度均有大幅提高，有利于在實際檢測中大幅增加反應通量。此外，本發明還提供了多層三維數字核酸擴增的制作方法與使用方法，可以使定量結果的準確性進一步得到改善。

技術領域

本發明涉及數字PCR領域，具體涉及一種多層三維數字核酸擴增芯片及其制作與使用方法。

背景技術

自從1983年PCR的發明以來，核酸定量已經從定性技術(PCR后電泳)發展到半定量(熒光定量PCR,qPCR)，隨著數字PCR(digital PCR,dPCR)的出現，已經發展到絕對定量。數字PCR技術通過將核酸模板隨機分配到大量的反應單元中進行擴增反應，擴增結束后對每個反應單元的熒光信號進行采集，由于核酸分子的隨機分配符合泊松分布，因此最后通過泊松分布公式計算即可得到樣品的原始濃度或含量。分區數目越大，核酸定量范圍越大，精度越高；總反應體積越大，檢測限越低。

數字PCR對核酸分子的定量檢測分為三步：分配代測樣品(partition)、核酸擴增、熒光檢測。根據分配策略的不同，目前的dPCR技術分為兩大類，分別是基于物理分隔的芯片數字PCR(chip-based digital PCR,cdPCR)和基于液滴乳化的液滴數字PCR(droplet-based digital PCR,ddPCR)。到目前為止，ddPCR由于其優點已成為生物和醫學領域最常用的方法。首先，液滴產生芯片的設計和制造相對容易。第二，液滴的大小和數量是靈活的，因此很容易產生數以百萬計的液滴。最后，液滴擴增產物可以很容易地回收，這在二代測序文庫定量的應用中很重要。但是，它有一些局限性，在PCR過程中，由于熱運動或油的蒸發，一些液滴會合并，這會導致液滴體積的差異，使核酸分子分配概率產生差異，不符合泊松分布，對精度產生顯著影響。此外，液滴dPCR還需要許多設施，包括液滴發生器、液滴傳輸系統和液滴計數系統，這增加了設備的初始成本，并需要持續消耗昂貴的材料。這些缺點阻礙了其在臨床上的廣泛應用。與ddPCR相比，cdPCR通過制造物理微孔分割樣品，成本更低，容易檢測，特別是在護理點檢測中，基于芯片的數字PCR的結果可以很容易地使用熒光顯微鏡進行檢測。但是由于其微孔數目較少，通量低，應用不是很廣泛。

目前，國內商品化的數字PCR平臺大多為ddPCR，雖然各大科研單位與機構對于成本更低的芯片數字PCR也有研究，但這些研究多聚焦于進樣方式、防止反應液蒸發等基礎問題，在反應單元的體積、數量、排列方面并未打破陳規，因此在靈敏度和通量等關鍵科學問題上難有較大的進展與突破。國外的一些研究雖然報道了能產生百萬級反應分區的數字PCR芯片，但采用的是提高芯片微孔面密度的策略，這種做法雖然提高了反應單元的數量，但是使得反應單元體積急劇下降，提高了精度卻不能兼顧靈敏度，應用范圍較窄，無法滿足癌癥早期篩查，新冠病毒診斷等分子診斷需求。而且面密度的提高導致芯片制作要求和成品損失率的升高，成本更高。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明提供了一種多層三維數字核酸擴增芯片及其制作與使用方法。

具體而言，本發明首先提供一種多層三維數字核酸擴增芯片，其包括：

層疊設置的多個微陣列芯片和一個儲水層芯片；

在每個所述微陣列芯片上設有進液口、第一分支型分配通道、若干微孔陣列、通油孔、蓄水圈和蓄水圈進出液口；其中，所述進液口和微孔陣列通過所述第一分支型分配通道連通設置；所述通油孔與所述微孔陣列通過第一分支型分配通道連接設置；所述蓄水圈進出液口通過所述蓄水圈連通設置；所述蓄水圈設置在所述微孔陣列與微陣列芯片的邊沿之間，且與所述微孔陣列不連通；所述第一分支型分配通道、微孔陣列和蓄水圈的高度小于所述微陣列芯片的厚度；而在不同層的微陣列芯片之間，所述進液口相互連通設置，所述通油孔相互連通設置，所述蓄水圈進出液口相互連通設置；