[發(fā)明專利]兩種改造的低免疫原性黃精凝集素蛋白

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110323835.0
• 申請(qǐng)日: 2021-03-26
• 公開（公告）號(hào): CN113121665B
• 公開（公告）日: 2023-03-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鮑錦庫;吳傳芳;鄭茹瀟;曹東煒;王意達(dá);陳宣銘;李洋均;鄧杰;周洵羽
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/42
• 分類號(hào): C07K14/42;C12N15/29;C12N15/70;A61K38/16;A61P31/18;A61P35/00;C12R1/19
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1.一種低免疫原性黃精凝集素改造蛋白，其特征在于，所述改造蛋白為mrPCL2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一種改造的黃精凝集素的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子如SEQ ID NO:3所示。

3.一種低免疫原性黃精凝集素改造蛋白，其特征在于，所述改造蛋白為mrPCL5，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

4.一種改造的黃精凝集素的核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子如SEQ ID NO:5所示。

5.一種權(quán)利要求1或3所述的黃精凝集素改造蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）將PCL的氨基酸序列第19位、第100位氨基酸進(jìn)行單突變，置換后的序列如SEQ IDNO:2，SEQ ID NO:4所示；設(shè)計(jì)合成RFP-g4s-mrPCL2基因，氨基酸序列SEQ ID NO：6，核酸序列見SEQ ID NO：7、RFP-g4s-mrPCL5基因，氨基酸序列SEQ ID NO：8，核酸序列見SEQ ID NO：9；

（2）構(gòu)建改造的黃精凝集素重組質(zhì)粒：將RFP-g4s-mrPCL2基因、 RFP-g4s-mrPCL5基因分別插入到載體p ET-21a的Nde I和Hind III限制酶切位點(diǎn)上；

（3）構(gòu)建含有RFP-g4s-mrPCL2基因、RFP-g4s-mrPCL5基因的重組表達(dá)菌株：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到克隆菌DH5α中提取質(zhì)粒，最后轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌Rosetta-gami B（DE3）plyss中；

（4）黃精凝集素改造蛋白mrPCL2、mrPCL5的制備：挑取表達(dá)菌Rosetta-gami B（DE3）plyss單克隆接種于5ml含15μg/ml Kan，100μg/ml Amp，34μg/ml Cam，12.5μg/ml Tet的LB培養(yǎng)液中，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1：100比例轉(zhuǎn)接入含Kan的LB培養(yǎng)基中后，37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)，使OD值達(dá)到0.5-0.6后，取部分菌液作為誘導(dǎo)前的對(duì)照，加入IPTG使得終濃度為0.5 mmol/L，37℃，200rpm振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h，誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，8000rpm離心10min，收集誘導(dǎo)表達(dá)后菌體，用鎳柱結(jié)合緩沖液Binding Buffer：20mMPB，500mMNaCl，10mM咪唑，pH=7.4，懸浮菌體，加入1mM PMSF，進(jìn)行超聲，超聲功率為52W，超聲3s，間隔7s，90次，超聲兩個(gè)循環(huán)，總時(shí)間30min，將超聲后的總蛋白樣品8000rpm，4℃，離心10min，收集上清蛋白樣，過0.22μm濾膜除去不溶物，開始上樣于預(yù)先已經(jīng)用Binding Buffer平衡好的Ni²⁺-Sepharose Fast Flow 親和層析柱，上完樣后，用Wash Buffer洗滌層析柱清洗未掛柱蛋白，最后用250mM咪唑濃度進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；后使用腸激酶和分子篩層析對(duì)融合蛋白進(jìn)行酶切和分離，獲得突變體蛋白，用dd H2O超濾，隨后凍干。

6.權(quán)利要求1或3 所述的黃精凝集素改造蛋白在制備抗腫瘤細(xì)胞增殖活性藥物中的應(yīng)用。