[發明專利]一種基于EHDV核心樣顆粒的阻斷ELISA抗體檢測試劑盒、制備方法及應用

有效

• 申請號: 202110322734.1
• 申請日: 2021-03-25
• 公開（公告）號: CN113049808B
• 公開（公告）日: 2022-02-25
• 發明（設計）人: 黃超華;花群義;曹琛福;史衛軍;吳江;林彥星;林永濤;翁巧玉;曾少靈;楊俊興
• 申請（專利權）人: 深圳海關動植物檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535;G01N33/569;G01N33/577
• 代理公司: 北京蕙識同聯專利代理事務所(特殊普通合伙) 11966
• 代理人: 張林

1.一種EHDV阻斷ELISA抗體檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，包括：

步驟1）酶標板制備：將EHDV CLPs包被到酶標板，所述EHDV CLPs為EHDV VP3和VP7蛋白組裝形成的空心顆粒；

步驟2）酶標抗體制備：用辣根過氧化物酶HRP標記的抗EHDV VP7蛋白的群特異性單克隆抗體作為酶標抗體；

所述步驟1）具體為：將所述EHDV CLPs用0.2M pH8.0的Tris鹽酸包被液稀釋至1.25μg/mL，每孔加入100μL，4℃包被12h，洗滌后加入200μL含3% BSA的封閉液，37℃封閉2h，洗滌后保存；

所述步驟2）酶標抗體濃度稀釋度為1:6000；

所述EHDV CLPs具體是通過SEQ ID NO.1所示的VP3和SEQ ID NO.2所示的VP7經重組表達制備；所述制備為將EHDV vp3基因和vp7基因依次插入至載體pFastBac^TM Dual，構建重組質粒pFastBac-Dual-vp3-vp7；將測序正確的重組質粒 pFastBac-Dual-vp3-vp7 轉化入DH10Bac，通過藍白斑、菌落PCR 進行篩選，獲得重組桿狀病毒質粒Bacmid-vp3-vp7；將重組桿狀病毒質粒Bacmid-vp3-vp7轉染Sf9細胞；收集sf9細胞，用不連續蔗糖密度梯度超速離心進行純化。

2.一種EHDV阻斷ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒由權利要求1所述方法制備。

3.根據權利要求2所述的阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括0.1mg/mL的四甲基聯苯胺TMB顯色液和2M硫酸溶液終止液。

4.根據權利要求3所述的阻斷ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于：所示試劑盒還包括陽性對照血清和陰性對照血清：所述陽性對照血清為經商品化試劑盒確定的EHDV陽性的牛血清；所述陰性對照血清為無EHDV且無疫苗接種的健康牛血清。

5.權利要求2-4中任一項所述的EHDV阻斷ELISA抗體檢測試劑盒在制備檢測EHDV感染或疫苗接種的待測樣品的產品中的應用。

6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述檢測為：在每孔加入100μL以PBST稀釋的待檢血清，稀釋比例為1:5，37℃孵育90 min；PBST洗滌3次；每孔加入100μL 1：6000稀釋的HRP標記的抗EHDV VP7單克隆抗體，37℃孵育45 min；PBST洗滌3次；每孔加入100μL TMB底物，室溫避光孵育10 min，每孔加入終止液50μL 2M H₂SO₄終止反應，酶標儀讀取OD₄₅₀值，計算阻斷率PI值；

當阻斷率PI≥24.36％時判定為陽性；PI≤19.74％時判定為陰性；19.74％＜PI＜24.36％時判定為可疑，需重復檢測1次，如果仍低于24.36％則判為血清抗體陰性。

7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述待檢血清為感染野毒株或應用過普通的EHDV弱毒疫苗、滅活疫苗或應用過非EHDV VP7缺失疫苗的反芻動物血清。