[發明專利]血液中中性粒細胞的分離方法和分離試劑盒

有效

• 申請號: 202110322415.0
• 申請日: 2021-03-25
• 公開（公告）號: CN112941025B
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發明（設計）人: 沈怡;凡小麗;沈夢益;黃晨;楊麗
• 申請（專利權）人: 四川大學華西醫院
• 主分類號: C12N5/0787
• 分類號: C12N5/0787
• 代理公司: 成都虹橋專利事務所(普通合伙) 51124
• 代理人: 黃鑫

本發明涉及血液中中性粒細胞的分離方法和分離試劑盒，屬于中性粒細胞分離技術領域。本發明提供了血液中中性粒細胞的分離方法，包括如下步驟：將中性粒細胞分離液、淋巴細胞分離液、全血依次加入離心管，使淋巴細胞分離液位于中性粒細胞分離液上方，全血位于淋巴細胞分離液上方，然后離心，即可分離得到中性粒細胞。本發明還提供了血液中中性粒細胞的分離試劑盒，含有分別獨立包裝的中性粒細胞分離液和淋巴細胞分離液。采用本發明分離方法或分離試劑盒，通過一次離心即可快速獲得純度為80％左右的中性粒細胞，而且可以實現一次離心同時分離中性粒細胞和紅細胞，具有很好的實用價值。

技術領域

本發明涉及血液中中性粒細胞的分離方法和分離試劑盒，屬于中性粒細胞分離技術領域。

背景技術

中性粒細胞在機體非特異性免疫防御反應中起著十分重要的作用，是機體抵御微生物病原體，特別是化膿性細菌入侵的重要吞噬細胞。外周血白細胞以中性粒細胞為主，正常情況下中性粒細胞占人外周血白細胞的50％～70％。急性感染或炎癥、廣泛的組織損傷或壞死、急性溶血和失血、急性中毒以及惡性腫瘤等情況時，外周血中性粒細胞的數量增高。目前已有報道分離人和動物中性粒細胞的方法，大多采用Percoll、Ficoll等單種分離液對稀釋后的外周血進行梯度離心獲取。但是，上述梯度離心法對于分離液濃度、操作細致性的要求十分嚴格，細小改變就很容易導致細胞分離失敗，而且耗時長，離心后所得細胞的純度差異較大，通常雜質細胞較多。市面上有些公司提供了商品化的中性粒細胞分離專用試劑，但分離效果仍因不同實驗因素有所影響，尤其是離心后細胞分層不清楚、混有雜細胞，使目標細胞純度受到影響(如圖1所示)。此外，也有報道通過多次離心獲取純度更高的中性粒細胞的方法，但增加離心次數、過長的離心時間都會對細胞造成一定破壞。

因此，提供一種能夠快速獲得高純度中性粒細胞的分離方法和分離試劑盒，具有重要意義。

發明內容

本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的目的在于提供血液中中性粒細胞的分離方法。本發明的另一目的在于提供血液中中性粒細胞的分離試劑盒。

本發明提供了血液中中性粒細胞的分離方法，包括如下步驟：將中性粒細胞分離液、淋巴細胞分離液、全血依次加入離心管，使淋巴細胞分離液位于中性粒細胞分離液上方，全血位于淋巴細胞分離液上方，然后離心，即可分離得到中性粒細胞。

進一步地，淋巴細胞分離液占分離液總體積的10％～20％。

進一步地，全血：分離液總體積的體積比為(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。試驗中發現，如果全血：分離液總體積的體積比大于1.2：0.8，分離效果有所下降。另外，當分離液用量達到分離液總體積：全血的體積比為1.2：0.8時，已足夠實現有效分離。

優選地，全血：分離液總體積的體積比為1：1。

進一步地，所述中性粒細胞分離液為PolymorphPrep。

進一步地，所述離心的條件為：于15～30℃離心400～600g，30～50min，升降速為8～9。優選地，所述離心的條件為：于15～30℃離心500g，35min，升降速為9。若細胞分層欠清晰，可選擇離心較長時間，如50min。

進一步地，所述的全血為外周血全血。

優選地，所述的全血為人外周血全血。

進一步優選地，所述的全血為人外周血EDTA抗凝全血。

最優選地，所述的人外周血EDTA抗凝全血在采集后于15～30℃保存且保存時間在4小時以下。

試驗中發現，如果使用采集后2-8℃冷藏保存、或采集后放置過夜、或采集時使用肝素抗凝的全血，容易導致分離效果下降。

本發明提供了含有中性粒細胞分離液和淋巴細胞分離液的組合物制備血液中中性粒細胞分離試劑盒的用途。