[發明專利]從大齡小鼠結腸固有層中分離純化固有淋巴樣細胞的方法

有效

• 申請號: 202110320410.4
• 申請日: 2021-03-25
• 公開（公告）號: CN113061575B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 易龍;糜漫天;候鵬飛;余利
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍陸軍軍醫大學
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 張晨

1.從大齡小鼠結腸固有層中分離純化固有淋巴樣細胞的方法，其特征在于：包括以下步驟，

A1、獲取周齡16～40周小鼠的結腸，經清洗、剪碎后置于離心管中，加入細胞解離液，在搖床上于37℃攪拌孵育20～30分鐘后進行渦旋混勻；

A2、去除上清液，再加入細胞解離液，在搖床上于37℃攪拌孵育20～30分鐘后再次渦旋混勻，得到第一混合液；

A3、將再次渦旋混勻后的第一混合液去除上清液，將結腸轉移到0～5℃的PBS溶液中，加入細胞消化液、0.3～0.5mol/L的氫氧化鐵和0.1～0.2mol/L的氫氧化鋁組成的混合溶液，在搖床上于37℃攪拌孵育20～30分鐘后利用80mm濾網進行初濾，得到第二混合液；

A4、對第二混合液用100μm濾網進行過濾，將結腸加入HBSS中離心，然后去除上清液之后，再加入HBSS重懸，并加入殼聚糖包覆改性羰基鐵，旋轉搖動得到第三混合液，對第三混合液使用60～80μm金屬過濾網過濾，在過濾過程中對過濾網通2～5mA的微弱電流，得到過濾液；

A5、將步驟A4得到的過濾液離心，然后用44％的第一Percoll液重懸后移至底部鋪有67％的第二Percoll液的離心管，800×g離心10～20分鐘；

A6、取中間層細胞收集，再次離心，收集沉淀；

A7、用稀釋后抗體混懸步驟A6所得的細胞團，離心，收集沉淀；

A8、用流式緩沖液重懸沉淀，上機流式細胞儀得到固有淋巴樣細胞；

所述殼聚糖包覆改性羰基鐵的制備方法，包括以下步驟，

B1、按質量份數，取5～8份的納米羰基鐵粉末放入容器中，加入20～30份的無水乙醇，使用超聲分散10～15分鐘，加入10～15份的氨水，然后加熱到35～40℃，在攪拌狀態下逐滴加入3～5份的正硅酸乙酯，攪拌均勻后反應4～5小時，在氮氣保護下進行抽濾、洗滌并烘干，得到改性羰基鐵；

B2、取8～10份的殼聚糖顆粒溶于100～200份的去離子水中，攪拌均勻得到殼聚糖溶液；將殼聚糖溶液以20～30kHz的功率超聲后，加入40～50份的乙酸，在40℃恒溫下攪拌1h，靜置；

B3、向步驟B2處理后的殼聚糖溶液中加入30～40份的正己烷，在攪拌狀態下滴入Span80進行預乳化，然后加入步驟B1中得到的改性羰基鐵和1～2份的三乙烯四胺，40℃恒溫下靜置1～2h；

B4、靜置后，以6000～8000r/min的速率攪拌10～20min，然后逐滴加入8～10份的環氧氯丙烷，40℃恒溫下靜置反應5h；

B5、用無水乙醇浸析，經離心分離、洗滌數次后，置于50℃真空箱中干燥，得到殼聚糖包覆改性羰基鐵。

2.根據權利要求1所述的從大齡小鼠結腸固有層中分離純化固有淋巴樣細胞的方法，其特征在于：所述步驟A1和A2中細胞解離液均為D-Hanks+10mM?HEPES+5mM?EDTA，所述D-Hanks、HEPES、EDTA的體積比為1:1:1。

3.根據權利要求2所述的從大齡小鼠結腸固有層中分離純化固有淋巴樣細胞的方法，其特征在于：所述步驟A3中細胞消化液為D-Hanks+500μg/mL膠原酶D+500μg/mL?DNase1+0.5U/mL分散酶+2％FBS溶液組成的混合溶液。

4.根據權利要求3所述的從大齡小鼠結腸固有層中分離純化固有淋巴樣細胞的方法，其特征在于：所述步驟A3中D-Hanks、500μg/mL膠原酶D、500μg/mL?DNase1、0.5U/mL分散酶和2％FBS溶液的體積比為1:1:1:1:1。

5.根據權利要求4所述的從大齡小鼠結腸固有層中分離純化固有淋巴樣細胞的方法，其特征在于：所述步驟A6和A7中再次離心采用20℃、800×g離心10～20分鐘。

6.根據權利要求5所述的從大齡小鼠結腸固有層中分離純化固有淋巴樣細胞的方法，其特征在于：所述稀釋后抗體是指含990μl流式緩沖液與10μl抗體原液，稀釋比為1:100。