[發明專利]柳杉激素脅迫下miRNA熒光定量內參基因及其引物的應用

有效

• 申請號: 202110317491.2
• 申請日: 2021-03-24
• 公開（公告）號: CN112980990B
• 公開（公告）日: 2023-01-17
• 發明（設計）人: 徐進;朱李娟;張瑩婷;胡海亮
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 南京申云知識產權代理事務所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天

本發明公開了柳杉激素脅迫下miRNA熒光定量內參基因及其引物的應用，屬于植物分子生物學領域。本發明根據文獻資料查閱和數據庫搜索最終選擇了本實施所需的13條候選內參基因，通過delta?CT、GeNorm、NormFinder和BestKeeper四個軟件對13個內參進行基因穩定性評價，以及RefFinder網址進行綜合分析結果，獲得了適用于柳杉GA₃脅迫下熒光定量內參基因cln?miR6725、novel1和18S，以及ABA脅迫下熒光定量內參基因U6和novel16。為柳杉不同激素脅迫下miRNA的相關功能基因的表達定量提供了有力的支持，因而具有重要的應用價值。

技術領域

本發明屬于植物分子生物學領域，更具體地說，涉及柳杉激素脅迫下miRNA熒光定量內參基因及其引物的應用。

背景技術

柳杉（Cryptomeria fortunei Hooibrenk ex Otto et Dietr），又名長葉孔雀松。喬木，其天然分布極其狹窄，主要分布在我國及日本等地。柳杉樹形優美，材質優良，適應性強，生長快而持久，具有耐寒冷、干旱和瘠薄，抗風抗雪壓能力等特性。脫落酸(ABA)是一種具有半萜結構的植物激素，在調節植物對逆境的適應中顯得尤為重要。它能抑制種子萌發、促進休眠、抑制生長、促進葉片衰老脫落等。GA₃對柳杉的花芽分化有顯著的促進作用，如日本柳杉施用GA₃可以顯著提早結實年齡。然而現在關于柳杉在ABA脅迫和GA₃脅迫情況下基因表達的差異的研究報道甚少，在此過程中，涉及到運用實時熒光定量技術分析和驗證基因的表達水平，就需要穩定可靠的內參基因，因此篩選柳杉不同激素脅迫條件下穩定表達的內參基因是實時熒光定量結果準確的關鍵因素。

發明內容

針對現有技術存在的上述問題，本發明所要解決的問題之一是獲得柳杉在不同激素脅迫條件下表達穩定的miRNA熒光定量內參基因的應用，能夠滿足實時熒光定量檢測柳杉其它基因轉錄表達水平的要求，提高柳杉基因表達分析研究的穩定性、可靠性和效率。本發明所要解決的另一問題是提供激素脅迫下miRNA熒光定量內參基因的引物的應用。

為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案如下：

本發明通過delta-CT、GeNorm、NormFinder和BestKeeper四個軟件對13個內參進行基因穩定性評價，通過RefFinder網址綜合分析結果，篩選出在不同激素脅迫條件下柳杉穩定表達的內參基因。

柳杉激素脅迫下miRNA熒光定量內參基因的應用，所述的激素脅迫是ABA脅迫或GA₃脅迫。

所述的ABA脅迫下柳杉miRNA熒光定量內參基因的應用中，所述的內參基因為U6和/或novel16基因，所述的novel16基因的核酸序列如SEQ ID NO .1所示。

所述的GA₃脅迫下柳杉miRNA熒光定量內參基因的應用中，所述的內參基因為cln-miR6725、novel1和18S基因，cln-miR6725基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .2所示；novel1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .3所示；18S基因的核苷酸序列如SEQ IDNO .4所示。

U6基因的引物序列在柳杉miRNA熒光定量中的應用，U6基因的引物序列如下：

U6正向引物：5′-ACAGAGAAGATTAGCATGGCC-3′；

U6反向引物：5′GACCAATTCTCGATTTGTGCG-3′。

novel16基因的引物序列在柳杉miRNA熒光定量中的應用，novel16基因的引物序列如下：

novel16正向引物：5′-GCGTTTTTCCAATACCTCCTATACC-3′；