[發(fā)明專利]一種牙周膜干細(xì)胞培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110316804.2
• 申請日: 2021-03-25
• 公開（公告）號: CN112899225A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 徐會娟;陳道林;陳龍劍
• 申請（專利權(quán)）人: 徐會娟
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明公開了一種牙周膜干細(xì)胞培養(yǎng)基，由以下成分組成：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、二羥丙茶堿、黃藤素、PDE 4抑制劑、谷胱甘肽、2?巰基乙醇。本發(fā)明提供一種牙周膜干細(xì)胞培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中添加二羥丙茶堿、黃藤素、PDE 4抑制劑協(xié)同作用，刺激牙周膜干細(xì)胞分裂，有效提高牙周膜干細(xì)胞的增殖能力，能在短時間內(nèi)獲得大量的牙周膜干細(xì)胞，提高細(xì)胞的增值速度，為牙周組織工程提供種子細(xì)胞來源，并且本發(fā)明的培養(yǎng)基不添加動物血清，提高了臨床應(yīng)用的安全性。本發(fā)明還提供了一種牙周膜干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，采用本發(fā)明提供的培養(yǎng)基，以傳代培養(yǎng)得到的P3?P5代細(xì)胞為培養(yǎng)對象，實現(xiàn)牙周膜干細(xì)胞的快速擴增，方法簡單易于操作，有效降低生產(chǎn)成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及干細(xì)胞領(lǐng)域，尤其涉及一種牙周膜干細(xì)胞培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

目前，牙周組織再生是治療牙周病的有效途徑和最終目的。然而，傳統(tǒng)治療、刮治、根面平整等基礎(chǔ)治療，只能消除病因，無法完全修復(fù)已喪失的牙周組織，療效甚微。隨著組織工程的發(fā)展，研究者們將復(fù)合的種子細(xì)胞與支架的復(fù)合物移植到缺損部位，為被破壞的牙周組織的再生帶來希望。

自2004年Seo等從牙周膜組織中分離出牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligamentstem cells,PDLSCs）以來，該細(xì)胞就被認(rèn)為是牙周組織工程的首選種子細(xì)胞，具有組我更新能力，能分化為牙周的三種組織：牙槽骨、牙周膜和牙骨質(zhì)。一系列現(xiàn)有研究均證明PDLSCs是治療牙周疾病的理想細(xì)胞。

傳統(tǒng)的牙周膜干細(xì)胞培養(yǎng)需要添加胎牛血清，有引入異源血清攜帶的細(xì)菌、病毒的風(fēng)險，再者血清培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)率、傳代次數(shù)有限，極大限制了牙周膜干細(xì)胞的應(yīng)用。牙周膜干細(xì)胞的研究和應(yīng)用需要足夠數(shù)量的細(xì)胞，因此就要求細(xì)胞在培養(yǎng)過程中具有較好的活性和增殖速度。對牙周膜干細(xì)胞的培養(yǎng)基提出了更高的要求。

現(xiàn)有技術(shù)中雖然公開了采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)牙周膜干細(xì)胞，但是，目前的牙周膜干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基存在培養(yǎng)的細(xì)胞活性差，增殖速率慢等問題，不能滿足牙周膜干細(xì)胞的科研或臨床需求，因此提高牙周膜干細(xì)胞的體外增殖能力顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種牙周膜干細(xì)胞培養(yǎng)基，成分明確，能有效實現(xiàn)牙周膜干細(xì)胞的體外快速擴增，為滿足牙周膜干細(xì)胞的使用需求提供保障。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種牙周膜干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。

本發(fā)明的目的之一采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種牙周膜干細(xì)胞培養(yǎng)基，由以下成分組成：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、二羥丙茶堿、黃藤素、PDE 4抑制劑、谷胱甘肽、2-巰基乙醇。

進一步地，以培養(yǎng)基終濃度計，各組分的質(zhì)量濃度為：二羥丙茶堿2.0-8.5μg/mL、黃藤素9.8-12.0μg/mL、PDE 4抑制劑5.0-10.0ng/mL、谷胱甘肽1.0-2.0μg/mL、2-巰基乙醇10.0-14.5μg/mL。

進一步地，以培養(yǎng)基終濃度計，各組分的質(zhì)量濃度為：二羥丙茶堿4.5μg/mL、黃藤素11.0μg/mL、PDE 4抑制劑8.5ng/mL、谷胱甘肽1.5μg/mL、2-巰基乙醇13.0μg/mL。

進一步地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基。

本發(fā)明的目的之二采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種牙周膜干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：將待培養(yǎng)的牙周膜干細(xì)胞接種于上述的培養(yǎng)基中，在37℃，5%CO₂的條件下進行培養(yǎng)。

進一步地，接種的牙周膜干細(xì)胞為傳代培養(yǎng)至P3-P5代細(xì)胞。

進一步地，所述牙周膜干細(xì)胞的接種密度為1-2×10⁴個/mL。

進一步地，在培養(yǎng)過程中每兩天更換一次培養(yǎng)基。