[發(fā)明專利]一種甾體16β-羥化酶CYP65重組酵母菌的構(gòu)建及其應用

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• 申請日: 2021-03-25
• 公開（公告）號: CN115125154A
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發(fā)明（設計）人: 劉曉光;賈曦;路福平
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N15/53;C12P33/14;C12R1/865
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本發(fā)明專利提供了一種表達甾體16β?羥化酶CYP65的重組酵母菌，它能夠高效轉(zhuǎn)化甾體底物4?AD，進而高效制備C16β?OH?4?AD。具體涉及利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了兩個敲除載體，并根據(jù)同源重組的原理定向敲除了酵母NS17中的醛酮還原酶基因GCY1和YPR1，獲得了一個雙敲除醛酮還原酶基因GCY1和YPR1的酵母菌NS17平臺。同未改造的酵母NS17菌株相比，該雙敲除酵母菌株對底物4?AD的還原明顯減少。將表達載體pYES2?CYP65分別轉(zhuǎn)化至雙敲除酵母菌株和原始酵母菌株NS17中，結(jié)果表明對底物4?AD的羥化特異性明顯提高。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用基因工程技術(shù)和分子生物學手段構(gòu)建一種表達16β-羥化酶的重組酵母菌株，該重組菌株可用于甾體藥物中間體C16β-OH-4-AD的高效制備。

背景技術(shù)：

甾體激素類藥物是指分子結(jié)構(gòu)中含有甾體結(jié)構(gòu)的激素類藥物，主要包括腎上腺皮質(zhì)激素和性激素兩大類，它具有抗炎，抗過敏等作用，在臨床上有重要的醫(yī)藥價值和藥理活性。甾體激素類藥物的生理和藥理活性取決于甾體骨架特定位點引入的官能基團。目前，主要通過化學合成法和微生物轉(zhuǎn)化法改造甾體的結(jié)構(gòu)。同化學合成法相比，甾體微生物轉(zhuǎn)化有許多優(yōu)勢：首先避免了化學合成法中的步驟繁瑣，顯著提高了產(chǎn)物得率；其次，微生物轉(zhuǎn)化專一性強，具有較高的立體選擇性，極大地減少了副產(chǎn)物的生成；同時微生物轉(zhuǎn)化過程是一個環(huán)境友好型綠色過程。

雄甾-4-烯-3，17-二酮(簡稱4AD)對機體有非常重要的調(diào)節(jié)作用，同時是一種重要的甾體激素類藥物中間體，不僅可以用來合成氫化可的松、黃體酮、地塞米松等多種藥物，也可用于生產(chǎn)性激素、皮質(zhì)激素等多種甾體激素類藥物。通過P450羥化酶的作用在母核上直接引入羥基可顯著提高其抗炎、抗感染等藥理活性。

目前，用于工業(yè)生產(chǎn)的甾體微生物轉(zhuǎn)化類型多集中在11α、11β、15α、15β、16α位置的羥基化，而有關(guān)C16β羥基化的報道仍然較少。本實驗室前期工作鑒定了來源于黑曲霉ATCC1015中的16β羥化酶基因CYP65，該基因編碼的羥化酶對甾體4AD具有很強的特異性以及很高的羥化活性。鑒于黑曲霉發(fā)酵工藝復雜且投料量低，因此構(gòu)建一個提高工藝效率、增加投料量且降低生產(chǎn)成本的更高效的工程菌具有重要的工業(yè)價值。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)酵母菌NS17生長更加旺盛，具有更大的研究價值。

釀酒酵母作為一個表達外源基因的平臺十分成熟，同時由于酵母NS17具有生長旺盛的特點，因此本發(fā)明以酵母NS17作為出發(fā)菌株，用于構(gòu)建一種表達16β-羥化酶的重組酵母菌株。由于酵母NS17中存在GCY1和YPR1兩個醛酮還原酶基因，在轉(zhuǎn)化甾體4AD時，會對4AD的第17位酮基造成還原，從而生成雙羥產(chǎn)物、影響了C16β-OH-4-AD單羥產(chǎn)物的生成。為了獲得C16β-OH-4-AD產(chǎn)物，需要對表達宿主NS17進行改造。本發(fā)明利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了兩個敲除載體，根據(jù)同源重組原理依次定向敲除了酵母NS17中的醛酮還原酶基因GCY1和YPR1，再利用該雙敲除酵母突變株作為出發(fā)菌株對甾體4AD進行轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明雙敲除酵母突變株對4AD的還原程度明顯降低。將表達載體PYES2-CYP65導入雙敲除突變株內(nèi)，構(gòu)建了表達16β-羥化酶的重組酵母菌株，用于高效制備甾體中間體C16β-OH-4-AD。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的在于提供了一種表達16β-羥化酶CYP65的重組酵母菌，同時也提供了一個雙敲除醛酮還原酶基因GCY1和YPR1的酵母表達平臺，為高效制備C16β-OH-4-AD奠定了堅實基礎。