[發明專利]聚合酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 202110316008.9
• 申請日: 2021-03-24
• 公開（公告）號: CN113122517B
• 公開（公告）日: 2023-02-14
• 發明（設計）人: 高亞平;何筠;陳麗伊;田暉
• 申請（專利權）人: 深圳清華大學研究院;安序源生物科技（深圳）有限公司
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/70;C12N1/21;C12Q1/6869;C12Q1/6844;C12R1/19
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 劉燚

本申請公開了聚合酶突變體及其應用。該聚合酶突變體包括如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列經過以下突變后的氨基酸序列：第368位的蘇氨酸突變為苯丙氨酸、第372位的蘇氨酸突變為亮氨酸、第375位的谷氨酸突變為絲氨酸或賴氨酸、第478位的賴氨酸突變為酪氨酸、第484位的丙氨酸突變為谷氨酸、第512位的賴氨酸突變為酪氨酸。該聚合酶突變體至少具有如下有益效果：發明人意外地發現，具有如SEQ ID No.1所示氨基酸序列的Phi29聚合酶的上述位點發生突變后獲得的突變體對于分子結構更復雜、分子量更大的核苷酸類似物底物具有更高的利用效率，可以有效利用核苷酸類似物進行模板DNA的復制和延伸。

技術領域

本申請涉及測序技術領域，尤其是涉及聚合酶突變體及其應用。

背景技術

自1977年第一代測序技術的發明，測序技術已歷經三代更迭發展。為適應廣大的市場需求，納米孔測序技術，憑借其小型化、自動化、低成本、高通量、高靈敏度等諸多優勢，成為世界公認的第四代測序技術。與傳統的測序技術不同，納米孔測序可以在不對DNA進行生物或化學處理的前提下，直接采用物理辦法讀出DNA序列。其原理可以描述為：單個堿基通過納米孔通道時，會引起通道電學參數的變化，對于A、C、T、G四種不同的堿基，其化學性質的差異所引起的電學參數的變化量也不同，對這些變化進行檢測可以得到相應堿基的類型從而實現測序。

DNA鏈高速通過納米孔的特性使得納米孔測序成為可能，但其速度一般在微秒級別，過快的速度使得檢測的信號質量較低甚至無法被檢測到。相比較而言，DNA與DNA酶發生結合時，受酶催化反應的速度限制，其速度在毫秒級別左右，這提示可以通過DNA酶來控制DNA鏈在納米孔中的通過速率，從而提高檢測信號質量。因此，研發人員嘗試將DNA外切酶與納米孔復合，當DNA鏈靠近納米孔時，DNA外切酶將核苷酸逐個剪下，剪下的核苷酸在電壓驅動下通過納米孔，相比于直接以DNA鏈通過的方式，速率放緩，對不同核苷酸的檢測信號更容易區分。但利用外切酶測序過程中仍有許多需要改進的地方。因此，更多的研究針對DNA聚合酶控制DNA的通過速率。例如，有報道提出一種使用經過修飾的核苷酸類似物和納米孔進行邊合成邊測序的方法，在該方法中，DNA聚合酶和納米孔復合，當DNA模板鏈上具有部分雜交的引物并與納米孔接觸時，DNA聚合酶催化經過修飾的核苷酸類似物合成互補鏈，通過對該過程中引起的納米孔電學參數的變化進行檢測以完成測序。

Phi29 DNA聚合酶即嗜熱脂肪芽孢桿菌的噬菌體Phi29中的p2蛋白。體外條件下，Phi29能夠催化寡核苷酸引物起始的延伸反應，而且特有的結構域組成和折疊使其具有高保真性和卓越的鏈置換能力，在眾多的商業化酶中，持續合成能力最高(70kb)、延伸速率最快(50-200bp/s)。然而，相比于一般的核苷酸，上述納米孔測序方法中所采用的核苷酸類似物的分子結構與天然核苷酸底物明顯不同，野生型Phi29 DNA聚合酶對經修飾的核苷酸類似物底物的利用效率較低。

發明內容

本申請旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本申請提出一種能夠對核苷酸類似物具有較高利用效率的聚合酶突變體及其應用。

本申請的第一方面，提供聚合酶突變體，該聚合酶突變體包括如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列經過以下突變后的氨基酸序列：第368位的蘇氨酸突變為苯丙氨酸(T368F)、第372位的蘇氨酸突變為亮氨酸(T372L)、第375位的谷氨酸突變為絲氨酸或賴氨酸(E375S或E375K)、第478位的賴氨酸突變為酪氨酸(K478Y)、第484位的丙氨酸突變為谷氨酸(A484E)、第512位的賴氨酸突變為酪氨酸(K512Y)。

其中，SEQ ID No.1所示的氨基酸序列如下：