[發明專利]一種提高釀酒酵母棕櫚油酸含量的方法

有效

• 申請號: 202110314423.0
• 申請日: 2021-03-24
• 公開（公告）號: CN112920960B
• 公開（公告）日: 2022-07-26
• 發明（設計）人: 劉軍鋒;龐杰;鄧利;王芳
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N9/02;C12N9/10;C12P7/6409;C12R1/865
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 白艷

本發明公開了一種提高釀酒酵母棕櫚油酸含量的方法。本發明提供了重組菌，為在產油脂釀酒酵母中進行如下1)的改造，得到的重組菌：1)提高所述產油脂釀酒酵母中OLE1基因的轉錄活性，得到的重組菌。本發明在產油較多的釀酒酵母菌株YS58中，過表達轉錄因子Mga2或截短的Mga2基因片段，提高調控Δ9去飽和酶的OLE1基因的表達水平，從而提高釀酒酵母棕櫚油酸的含量，同時表達外源脂肪酸延長酶基因KCS與FAE，構建釀酒酵母基因工程菌，提高了釀酒酵母中棕櫚油酸的含量。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種提高釀酒酵母棕櫚油酸含量的方法。

背景技術

棕櫚油酸(palmitoleic acid)是一種16碳的單不飽和脂肪酸，雙鍵位于碳端的第7個碳原子上(C16:1n-7)。其具有廣泛的醫藥和化妝品應用，對肥胖癥、糖尿病、脂肪肝等慢性病具有一定的療效，在降血糖、抗炎、改善皮膚色素沉著以及食品領域具有應用潛力。目前，魚油等海產品是棕櫚油酸的主要來源，但由于國際上禁捕鯨魚和漁業資源匱乏，棕櫚油酸來源受限。因此人們一直在努力擴大從微生物來源分離這種脂肪酸的可能性。

棕櫚油酸作為生物代謝產物，主要以甘油三酯、磷脂或者甘油糖酯的形式存在。在釀酒酵母中，不飽和脂肪酸的形成是由于Δ9去飽和酶的作用，OLE1基因負責編碼Δ9去飽和酶，轉錄因子Mga2通過控制OLE1基因的轉錄以及其mRNA的穩定性來調節不飽和脂肪酸的代謝。Mga2通過TM跨膜結構域的色氨酸殘基可感知細胞膜上的不飽和脂肪酸的水平并結合配體，從而調節Mga2的轉錄活性，而膜上較高的不飽和脂肪酸水平導致Mga2的轉錄活化受到抑制，從而使脂肪酸脫氫酶的表達無法激活。而其IPT結構域、錨蛋白重復序列對不飽和脂肪酸合成的調控作用也尚未明確。

脂肪酸從頭合成過程中C2到C4；C4到C16；C16到C18這三個階段所用到的3-酮酰基-ACP合酶(KCS)是不同的。KCSIII負責將乙酰輔酶A和甲酰基輔酶A縮合成四碳單元，然后KCSI負責將四碳單元延伸到C16；最后一步KCSII負責C16到C18的延伸，其中C16和C18系脂肪酸是大部分動植物細胞脂肪酸組成的主要成分。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種重組菌。

本發明提供的重組菌，為在產油脂釀酒酵母中進行如下1)的改造，得到的重組菌：

1)提高所述產油脂釀酒酵母中OLE1基因的轉錄活性，得到的重組菌。

上述重組菌中，所述提高產油脂釀酒酵母中OLE1基因的轉錄活性為提高所述產油脂釀酒酵母中OLE1基因的轉錄因子Mga2或其截短體的編碼基因的表達量(過表達Mga2)；

所述轉錄因子Mga2的氨基酸序列為序列表中序列4；

所述轉錄因子Mga2截短體的氨基酸序列為序列表中序列4第1-975位；

或所述轉錄因子Mga2截短體的氨基酸序列為序列表中序列4第1-706位。

或所述轉錄因子Mga2或其截短體的編碼基因的啟動子為釀酒酵母強啟動子，如PGK1或TEF1。

本發明Mga2過表達方法是將基因采用T4連接的方法克隆至YEplac112-P_PGK-T_CYC載體上，并采用釀酒酵母強啟動子PGK1啟動表達。

上述重組菌中，所述重組菌為在在產油脂釀酒酵母中進行所述1)和如下2)的改造，得到的重組菌：

2)使所述產油脂釀酒酵母表達脂肪酸延伸酶。

上述KCS與FAE表達是采用T4連接以及無縫克隆的方法將基因序列克隆至pYES2.0載體，采用強啟動子TEF1或PGK1啟動表達，KCS的啟動子為TEF1或PGK1，FAE的啟動子為PGK1。