[發明專利]一種氧化葡萄糖酸桿菌中提高2-KLG產量的方法

有效

• 申請號: 202110308849.5
• 申請日: 2021-03-23
• 公開（公告）號: CN112899211B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發明（設計）人: 周景文;秦志杰;楊宇彤;李江華;陳堅;曾偉主;堵國成
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/113;C12N15/90;C12P7/60;C12R1/01
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 彭素琴

本發明公開了一種氧化葡萄糖酸桿菌中提高2?KLG產量的方法，屬于基因工程和生物工程技術領域。本發明利用基于sacB的基因組編輯系統，在氧化葡萄糖酸桿菌的末端氧化酶bo₃翻譯起始位點上游插入強啟動子P₁₁₄增強了末端氧化酶bo₃表達量，促進了酶催化過程中的輔因子再生及電子傳遞，減少了活性氧的產生，過量表達山梨糖/酮脫氫酶SNDHSDH后得到的2?KLG產量是野生型氧化葡萄糖酸桿菌WSH?003過量表達SNDHSDH得到的2?KLG產量的2.44倍。

技術領域

本發明涉及一種氧化葡萄糖酸桿菌中提高2-KLG產量的方法，屬于基因工程及生物工程技術領域。

背景技術

氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)是一種好氧、桿狀革蘭氏陰性菌，因其卓越的糖醇不完全氧化能力，在維生素C、二羥基丙酮、米格列醇等諸多產品生產中發揮著重要作用。氧化葡萄糖酸桿菌非凡的底物轉化能力主要依賴于其細胞膜上眾多高活性的酶，這些酶通常以吡咯喹啉醌(PQQ)或者黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔因子，酶催化產生的電子理論上直接傳遞給輔酶Q₁₀(CoQ₁₀)進行輔因子的再生，被還原的CoQ₁₀再經末端氧化酶bo₃或bd氧化。膜上的酶、CoQ₁₀與末端氧化酶構成了酶催化的輔因子再生及電子傳遞鏈系統。

高強度的底物不完全氧化產生大量的電子，這些電子有的可能來不及經電子傳遞鏈傳遞而導致電子泄露，這些泄露的電子產生大量活性氧，如過氧化氫等，嚴重影響細胞的正常生理狀態。在好氧發酵條件下，末端氧化酶bo₃發揮著主要作用。因此，提高末端氧化酶bo₃表達量可能促進CoQ₁₀的再生，進而促進整個電子傳遞鏈的電子傳遞能力，減少活性氧的產生，降低對細胞正產生理狀態的影響，改善酶催化環境。

發明內容

[技術問題]

現有技術都是通過對外源表達山梨糖脫氫酶的基因sdh、編碼山梨酮脫氫酶的基因sndh的質粒進行基因工程改造來達到2-KLG產量的提升，沒有直接對氧化葡萄糖酸桿菌基因組直接進行編輯來提高2-KLG產量的方法。

[技術方案]

本發明通過sacB基因組編輯系統，對氧化葡萄糖酸桿菌基因組進行改造，以提供一種可以提高2-KLG產量的重組菌。

本發明通過基于sacB的基因組編輯系統，構建出一個氧化葡萄糖酸桿菌基因組上末端氧化酶bo₃前插入了強啟動子P₁₁₄的重組菌。

本發明的第一個目的是提供一株重組菌，所述重組菌是以氧化葡萄糖酸桿菌為出發菌株；所述重組菌基因組上末端氧化酶bo₃上游含有啟動子P₁₁₄。

在一種實施方式中，所述氧化葡萄糖酸桿菌包括氧化葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)WSH-003。

在一種實施方式中，所述重組菌還過表達山梨糖/酮脫氫酶SNDHSDH。

在一種實施方式中，所述過表達山梨糖/酮脫氫酶是將含有山梨糖/酮脫氫酶基因的質粒轉入氧化葡萄糖酸桿菌。

在一種實施方式中，所述含有山梨糖/酮脫氫酶基因的質粒包括但不限于pBBRMCS5。

在一種實施方式中，所述山梨糖/酮脫氫酶基因受啟動子P₁₁₄啟動表達。

在一種實施方式中，所述啟動子P₁₁₄的核苷酸序列為氧化葡萄糖酸桿菌WSH-003基因組Scaffold3上的第468598～469103位。