[發明專利]血清4型禽腺病毒反向遺傳疫苗株rR188I及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202110308742.0
• 申請日: 2021-03-23
• 公開（公告）號: CN113151193B
• 公開（公告）日: 2023-08-01
• 發明（設計）人: 潘青;王笑梅;高玉龍;祁小樂;劉長軍;崔紅玉;劉愛晶;張艷萍;李凱;高立
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所（中國動物衛生與流行病學中心哈爾濱分中心）
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N15/63;C12N15/66;A61K39/235;A61P31/20
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 馬鑫

1.血清4型禽腺病毒反向遺傳疫苗株，其特征在于，所述的疫苗株是通過將我國FAdV-4新近分離株HLJFAd15的Hexon基因的第563位堿基由G突變為A，即編碼的第188位氨基酸由R突變為I，然后通過病毒拯救后獲得的；所述的FAdV-4新近分離株HLJFAd15的全基因組GenBank序列號為KU991797.1。

2.如權利要求1所述的血清4型禽腺病毒反向遺傳疫苗株，其特征在于，所述的血清4型禽腺病毒反向遺傳疫苗株是通過以下方法構建得到的：

(1)含有HLJFAd15毒株完整基因組的粘粒的構建

獲得FAdV-4新近分離株HLJFAd15毒株的全基因序列，HLJFAd15的全基因組GenBank序列號為KU991797，連接至pCC1Fos載體，經噬菌體包裝后電轉進EPI300感受態細胞中，涂布在氯霉素抗性LB平板上，挑取陽性克隆，經ZR?BAC?DNA?miniprep?Kit提取粘粒后，使用載體通用引物測序，得到含有HLJFAd15毒株完整基因組的粘粒，命名為Fos-rFAdV4；

(2)rR188I感染性克隆粘粒的構建

將HLJFAd15的Hexon基因克隆至pCAGGS載體中，所用引物為pCAGGS-Hexon?F/R，然后將Hexon基因的第563位堿基由G突變為A，即編碼的第188位氨基酸由R突變為I，所用引物為pR188I?F/R，生成突變質粒pCAGGS-Hexon-R188I；接著使用Counter-Selection?BACModification?Kit構建rR188I感染性克隆粘粒，方法如下：首先將步驟(1)構建的Fos-rFAdV4電轉進DH10B感受態細胞中，通過氯霉素抗生素篩選陽性克隆；然后再將Counter-Selection?BAC?Modification?Kit試劑盒中的重組酶質粒pRed?E/T電轉進含Fos-rFAdV4的DH10B感受態細胞中，通過氯霉素和鏈霉素篩選陽性克隆；以Counter-Selection?BACModification?Kit試劑盒中的rpsl-neo表達盒DNA為模板，使用引物R188I-rpslneo?F和R188I-rpslneo?R擴增帶有需替換Hexon基因片段兩端各50bp同源臂的rpsl-neo表達盒，將回收的PCR產物直接轉化進入經L-阿拉伯糖誘導的含有Fos-rFAdV4和pRed?E/T的DH10B感受態細胞中，即可替換原始Hexon基因，通過氯霉素、鏈霉素和卡那霉素抗生素篩選陽性克隆，得到Fos-rFAdV4-Hexon-rpslneo；再以相同方式，以pCAGGS-hexon-R188I質粒為模板，所述的pCAGGS-hexon-R188I質粒為HLJFAd15毒株Hexon基因克隆到pCAGGS中得到，使用引物R188I?F和R188I?R擴增突變的Hexon基因，將PCR產物電轉進上一步陽性克隆制備的經L-阿拉伯糖誘導的含Fos-rFAdV4-Hexon-rpslneo的DH10B感受態中，通過鏈霉素和氯霉素抗生素篩選得到Hexon基因的第563位堿基由G突變為A，即第188位氨基酸由R突變為I的陽性克隆，命名為Fos-rR188I；引物序列如下：

pCAGGS-Hexon?F：CATCATTTTGGCAAAGAATTCGCCACCATGGCGGCCCTCACGCCCGACCTG

pCAGGS-Hexon?R：GTCAGGAACATCGTATGGGTACACGGCGTTGCCTGTGGCGAAAGG

pR188I?F：CAGGGACCCGGAAtAAATCCTCTGCGA

pR188I?R：TCGCAGAGGATTTaTTCCGGGTCCCTG

R188I-rpslneo?F：CACGGCTTACAACCCGCTGGCTCCCAAGGAGTCCATGTTTAACAACTGGTGGCCTGGTGATGATGGCGGGATCG

R188I-rpslneo?R：GTGTCGAACACGCCATAGAGCATGTACACGTAAGTGGGATCATCCATGGGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG

R188I?F：CACGGCTTACAACCCGCTGGCTCC

R188I?R：GTGTCGAACACGCCATAGAGCATG

(3)病毒拯救

用QIAGEN質粒中提試劑盒提取Fos-rR188I粘粒，用FseI限制性內切酶進行線性化，通過醇沉回收DNA，將LMH細胞接種至6孔板，用轉染試劑X-tremeGene?HP?DNA?TransfectionReagent?Kit轉染線性化的Fos-rR188I，轉染后6h更換新鮮培養基，5d后將6孔板放入-80℃冰箱反復凍融3次，離心，收集上清，即為拯救所獲的rR188I重組毒。