[發(fā)明專利]一種基于序列設(shè)計的無細(xì)胞體系線形模板降解抑制方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110307923.1
• 申請日: 2021-03-23
• 公開（公告）號: CN112899272B
• 公開（公告）日: 2022-07-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 盧元;陳鑫杰
• 申請（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/70
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 陳波

本發(fā)明屬于合成生物學(xué)蛋白表達(dá)模板設(shè)計領(lǐng)域，具體提供了一種基于序列設(shè)計的用于大腸桿菌無細(xì)胞基因表達(dá)體系線形基因模板降解抑制的方法：向線形基因模板的端部添加規(guī)律的富含鳥嘌呤、胞嘧啶堿基對的保護(hù)序列來抑制線形基因模板在無細(xì)胞基因表達(dá)體系內(nèi)的降解；本發(fā)明的方法能夠有效提高基于線形基因模板的無細(xì)胞基因表達(dá)體系的蛋白表達(dá)量，推動基于線形基因模板的無細(xì)胞基因表達(dá)體系的發(fā)展，擴(kuò)大無細(xì)胞基因表達(dá)體系的應(yīng)用范圍。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于合成生物學(xué)蛋白表達(dá)模板設(shè)計領(lǐng)域，具體涉及一種用于無細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)模板設(shè)計的方法。

背景技術(shù)

無細(xì)胞基因表達(dá)在生命科學(xué)中用作基礎(chǔ)研究工具已有五十多年的歷史。但數(shù)十年來一些關(guān)鍵因素限制了其在工程應(yīng)用上的潛力：蛋白質(zhì)產(chǎn)量低且不穩(wěn)定，反應(yīng)時間不足，試劑成本較高，反應(yīng)規(guī)模小，無法正確折疊復(fù)雜蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)組件，轉(zhuǎn)錄限于內(nèi)源性細(xì)胞RNA聚合酶。近年來，技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)開始系統(tǒng)地解決這些局限性，從而使得無細(xì)胞基因表達(dá)能夠在新興的合成生物學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。近年來，以線形DNA為模板的無細(xì)胞基因表達(dá)逐漸受到人們的關(guān)注。無細(xì)胞基因表達(dá)體系通常采用環(huán)形質(zhì)粒DNA作為模板。與環(huán)形質(zhì)粒DNA相比，線形DNA的構(gòu)建更為簡單。環(huán)形質(zhì)粒DNA的克隆通常是將目標(biāo)質(zhì)?；D(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，而后通過細(xì)胞克隆，從細(xì)胞中提取出大量的目標(biāo)質(zhì)粒。而線形DNA的獲取只需通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction, PCR）擴(kuò)增得到復(fù)數(shù)的線形DNA，簡化了克隆步驟，進(jìn)一步縮短了實(shí)驗(yàn)周期，提高了實(shí)驗(yàn)效率。以線形DNA為模板的無細(xì)胞基因表達(dá)也因此得到了更為廣泛的應(yīng)用。

目前，以線形DNA為模板的無細(xì)胞基因表達(dá)仍存在一些問題，阻礙了其進(jìn)一步的發(fā)展。其中主要的一個問題就是以線形DNA為模板的無細(xì)胞基因表達(dá)蛋白質(zhì)的表達(dá)量遠(yuǎn)低于以環(huán)形質(zhì)粒DNA為模板的無細(xì)胞基因表達(dá)。造成這種差異的主要原因是線形DNA易被無細(xì)胞基因表達(dá)體系中細(xì)胞提取物中的DNA酶降解。在相關(guān)的DNA酶中，RecBCD酶被認(rèn)為是主要降解線形DNA的核酸外切酶?；谶@一點(diǎn)，目前的研究主要集中在抑制RecBCD酶的活性上。為抑制RecBCD酶的活性，前人的嘗試包括利用GamS蛋白抑制RecBCD酶的活性；篩選合適的小分子抑制劑抑制RecBCD酶的活性；將線形DNA與材料結(jié)合抑制線形DNA降解。但目前的研究僅局限于添加外源的抑制劑或者保護(hù)劑來提高線形DNA在無細(xì)胞基因表達(dá)體系內(nèi)的穩(wěn)定性，并且目前的穩(wěn)定效果均有限。此外，這種添加外源的抑制劑或者保護(hù)劑的方式操作復(fù)雜，成本較高，缺乏足夠的靈活性，且會對無細(xì)胞基因表達(dá)體系本身產(chǎn)生一定的擾動。

盡管已經(jīng)有研究基于無細(xì)胞基因表達(dá)體系內(nèi)線形DNA的降解問題給出了一定的解決方法。但目前的抑制效果仍十分有限，且缺乏足夠的靈活性，不能滿足無細(xì)胞基因表達(dá)體系對蛋白質(zhì)合成的要求。因此需要開發(fā)一種更加簡便且有效的無細(xì)胞基因表達(dá)體系線形DNA模板的降解抑制方法。而序列設(shè)計在線形DNA降解抑制中的重要作用仍未被挖掘。通過序列設(shè)計的方式提高線形DNA在無細(xì)胞基因表達(dá)體系內(nèi)的穩(wěn)定性為線形表達(dá)模板的降解問題提供了一種簡便可行的解決方案，不僅成本低廉，設(shè)計靈活，并且擁有廣闊的研究前景。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題：

一方面：本申請?zhí)峁┝艘环N基于序列設(shè)計的用于大腸桿菌無細(xì)胞基因表達(dá)體系線形基因模板降解抑制的方法，其特征在于：向其中線形基因模板的端部添加規(guī)律的富含鳥嘌呤、胞嘧啶堿基對的保護(hù)序列來抑制線形基因模板在無細(xì)胞基因表達(dá)體系內(nèi)的降解。

進(jìn)一步地，向線形基因模板的兩端添加規(guī)律的富含鳥嘌呤、胞嘧啶堿基對的保護(hù)序列

進(jìn)一步地，所述無細(xì)胞基因表達(dá)體系為基于大腸桿菌細(xì)胞提取物的無細(xì)胞體系。

進(jìn)一步地，所述線形基因模板為線形DNA，其獲得方式為以質(zhì)粒模板進(jìn)行PCR。

進(jìn)一步地，所述規(guī)律的富含鳥嘌呤、胞嘧啶堿基對的保護(hù)序列GC含量為60-65%，優(yōu)選為選自SEQ ID NO.1-6的序列。