[發明專利]適用于肟菌酯農藥的免疫層析金標試紙條及其速測法

在審

• 申請號: 202110307694.3
• 申請日: 2021-03-23
• 公開（公告）號: CN113109559A
• 公開（公告）日: 2021-07-13
• 發明（設計）人: 賈惠言;付巖;凌淑萍;王全勝;吳銀良
• 申請（專利權）人: 寧波市農業科學研究院
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/543
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司 33102
• 代理人: 袁忠衛

1.一種適用于肟菌酯農藥的免疫層析金標試紙條，其包括襯板、硝酸纖維素膜、金標抗體結合墊、樣品墊、吸水墊，其特征是：所述金標抗體結合墊上包被有膠體金標記的肟菌酯特異性的抗體，硝酸纖維素膜分別包被有用于間接競爭的肟菌酯人工抗原檢測線和羊抗兔IgG質控線。

2.根據權利要求1所述的適用于肟菌酯農藥的免疫層析金標試紙條，其特征是：膠體金標記的肟菌酯特異性的抗體是由20～30nm的納米金顆粒與肟菌酯特異性抗體相結合的復合物，肟菌酯特異性抗體與膠體金的結合濃度為40～60mg/L。

3.根據權利要求1所述的適用于肟菌酯農藥的免疫層析金標試紙條，其特征是：檢測線包被的用于間接競爭的肟菌酯人工抗原是指將肟菌酯半抗原偶聯到OVA(雞卵清蛋白)上的人工抗原，濃度為550～650mg/L；這種農藥半抗原與OVA的偶聯比為8:1～12:1。

4.根據權利要求1所述的適用于肟菌酯農藥的免疫層析金標試紙條，其特征是：羊抗兔IgG的質控線的濃度為900～1100mg/L。

5.根據權利要求1所述的適用于肟菌酯農藥的免疫層析金標試紙條，其特征是：所述檢測線和質控線所用的稀釋液是質量濃度1～5％蔗糖的0.01M、pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液。

6.根據權利要求1所述的適用于肟菌酯農藥的免疫層析金標試紙條，其特征是：所述肟菌酯特異性的抗體是由(E)-2-(甲氧亞氨基)2-(2-((E)1-(3-(三氟甲基)苯基)亞乙基氨基氧基)甲基)苯基)乙酸(TFA)作為半抗原，偶聯BSA或OVA，其摩爾比為15:1～20:1，制備免疫原與包被原的整個體系的pH應為7.3～7.5，將半抗原同免疫佐劑混合，制備肟菌酯完全抗原并免疫日本大耳白兔，制備能與肟菌酯特異反應的多克隆抗體。

7.根據權利要求6所述的適用于肟菌酯農藥的免疫層析金標試紙條，其特征是：所述肟菌酯特異性的抗體其具體制備基本步驟為：

(1)人工半抗原合成：(E)-2-(甲氧亞氨基)2-(2-((E)1-(3-(三氟甲基)苯基)亞乙基氨基氧基)甲基)苯基)乙酸(TFA)；5克肟菌酯、甲醇70mL和5M氫氧化鈉水溶液12.5mL回流攪拌；水解完成后，根據薄膜層析監測約5h，用5M HCl水溶液中和反應混合物，甲醇蒸發；在殘渣中加水，用乙酸乙酯萃取去除中性雜質；水層冷卻至0℃，用2M HCl溶液酸化至pH3，用乙酸乙酯萃取，鹽水洗滌，最后用無水MgSO₄干燥；蒸發得到4.48g澄清液，再用體積比95:5的正己烷/丙酮再結晶得到3.52g酸衍生物，為72.9％的白色結晶；

(2)完全抗原和包被原的合成：將0.1mmol半抗原、0.1mmol NHS、0.1mmo1 DCC分別用1.0mL DMF溶解；磁力攪拌下，向上述半抗原和NHS中逐滴加入DCC溶液，室溫攪拌反應1h，4℃冰箱中攪拌過夜；次日，離心取上清，在攪拌狀態下，將上清逐滴加入5.0mL 0.001mmolBSA或OVA的pH8.0硼酸緩沖液中，約半小時加完，室溫磁力攪拌反應1h，4℃攪拌反應過夜，次日取出；溶液轉入透析袋，pH7.4的PBS緩沖液透析3天，4℃，每4h換水一次，凍干保存；

(3)在此基礎上，用制備的免疫原免疫日本大耳白兔，制備針對肟菌酯的高靈敏度的多克隆抗體。

8.一種利用權利要求1～7任一所述的試紙條進行草莓中肟菌酯速測法，其特征是：將草莓樣品勻漿或切碎，稱取5g待測樣品于5mL樣品稀釋液中，并加入一份配套研磨珠，充分震蕩混勻2min，提取完成后靜置3min，取上清液滴加2～3滴到樣品墊的點樣區中進行層析反應，5～10分鐘后根據檢測線和質控線的顯色情況直接判斷草莓樣品中肟菌酯農藥的陰陽性結果；質控線顯紅色表示試紙條有效，未顯色則失效；檢測線顯紅色或淺紅色則判斷為陰性或偏陽性，表示草莓中未檢出肟菌酯，或草莓中肟菌酯濃度低于其相對應的最低檢出限；檢測線未顯色則判斷為陽性，表示草莓中肟菌酯濃度高于其相對應的最低檢出限。