[發明專利]生物素化的轉座體在回收CUTTag或ATAC-seq產物中的用途及方法

在審

• 申請號: 202110305115.1
• 申請日: 2021-03-23
• 公開（公告）號: CN112795563A
• 公開（公告）日: 2021-05-14
• 發明（設計）人: 韋曄;李科;張清儀;崔利蘭;楊慶明
• 申請（專利權）人: 上海欣百諾生物科技有限公司;吳江近岸蛋白質科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806;C40B50/06
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 許亦琳;余明偉

本發明涉及分子生物學、基因組學以及生物技術領域，特別是涉及生物素化的轉座體在回收CUTTag或ATAC?seq產物中的用途及方法，所述生物素化的轉座體選自攜帶有轉座酶的融合蛋白與能和轉座酶結合的生物素化接頭?末端復合體形成的生物素化的轉座體，和/或，轉座酶與生物素化接頭?末端復合體結合形成的生物素化的轉座體；所述攜帶有轉座酶的融合蛋白包括轉座酶和具有結合抗體Fc段功能的蛋白。生物素化的轉座體可用于回收CUTTag或ATAC?seq產物。本申請提供的回收方法在便捷快速、具有更高的產物回收效率，沒有明顯底物損失，特別適用于少量細胞的表觀遺傳學和染色質狀態研究。

技術領域

本發明涉及分子生物學、基因組學以及生物技術領域，特別是涉及生物素化的轉座體在回收CUTTag或ATAC-seq產物中的用途及方法。

背景技術

染色質靶向切割和標簽化（Cleavage under target and tagment, CUTTag）是近年興起的一種新型蛋白質-染色質相互作用研究方法，該方法結合了轉座-可及染色質實驗（Assay for Targeting Accessible-Chromatin with high-throughout sequencing，ATAC-seq）和染色質核酸酶靶向切割和釋放策略（Cleavage under target and releaseunder nuclease, CUTRUN）的特點，利用protein A/protein G融合Tn5的融合蛋白，通過protein A/G-抗體相互作用將轉座體栓系在靶抗體周圍的區域，從而實現目標特異性的片段化反應。相比于傳統的ChIP-seq，CUTTag操作相對簡單、無需甲醛交聯、信噪比較高、所需測序量少且適用于極低起始量和單細胞的應用場景。CUTTag和ATAC-seq所使用的轉座體需要加入SDS失活，體系中存在的SDS會干擾后續的PCR反應，因此必須進行DNA提取或利用其他方法消除SDS的干擾。現有的CUTTag/ATAC-seq產物回收或后續處理方法主要包括酚氯仿抽提-乙醇沉淀法，片段分選（Solid-phase reversible immobilization, SPRI）磁珠回收法、離心柱回收法和直接PCR法，其中酚氯仿抽提-乙醇沉淀法操作繁瑣、耗時長、效率相對低下；SPRI beads回收法會損失小于150bp的片段，從而造成信號的損失；離心柱回收法需要高質量的離心柱，增加了耗材成本；而直接PCR法則在部分抗體上會損失大于300bp的片段，并且建庫效果受到擴增酶和延伸時間的影響較大。現有的CUTTag產物回收/后續處理方法均存在各自的缺陷，影響了CUTTag技術更廣泛的應用，所以建立一種通用型的便捷、快速、無底物損失的CUTTag/ATAC-seq產物回收方法就顯得非常必要。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供生物素化的轉座體在回收CUTTag或ATAC-seq產物中的用途及方法，用于解決現有技術中的問題。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明提供生物素化的轉座體在回收CUTTag或ATAC-seq產物中的用途，所述生物素化的轉座體選自攜帶有轉座酶的融合蛋白與能和轉座酶結合的生物素化接頭-末端復合體形成的生物素化的轉座體，和/或，轉座酶與生物素化接頭-末端復合體結合形成的生物素化的轉座體；所述攜帶有轉座酶的融合蛋白中還包括具有結合抗體Fc段功能的蛋白，所述具有結合抗體Fc段功能的蛋白選自Protein A、Protein G或Protein L中的兩種以上。

本發明還提供一種與靶蛋白結合的片段化核酸產物的回收方法，所述回收方法包括以下步驟：

1）選自以下任一：

1a）將細胞核或透化的細胞與抗體和生物素化的轉座體共同孵育；通過抗體引導的生物素化的轉座體進行酶切反應并產生含有接頭序列的片段；

1b) 將細胞核或透化的細胞與生物素化的轉座體共同孵育；通過生物素化的轉座體直接進行酶切反應并產生含有接頭序列的片段；

2）將步驟1）中所加入的生物素化的轉座體失活，使得生物素化的片段被釋放至溶液上清中；