[發明專利]新的農藥增效技術及其應用

在審

• 申請號: 202110304984.2
• 申請日: 2021-03-24
• 公開（公告）號: CN113046351A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 蘇建亞;胡波;胡松竹
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/65;C12Q1/6888
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

新的農藥增效技術及其應用。本發明公開甜菜夜蛾與褐飛虱P450基因的上游調控序列，以及利用這些上游調控序列建立的轉錄抑制劑篩選方法。害蟲對殺蟲劑的代謝抗性是由于P450等解毒酶基因組成型上調表達所致，這種上調表達受其上游調控序列的控制，抑制調控序列的轉錄活性可下調解毒基因的轉錄，提高殺蟲劑的防效。本發明所述上游調控序列負責抗性相關P450基因的上調表達。將這些調控序列分別整合到熒光報告質粒中，通過轉染使熒光報告質粒在細胞中表達，熒光信號強度受插入序列的控制。在轉染細胞中加入抑制劑可影響這些調控序列對熒光素酶的轉錄，從而影響熒光信號強度。利用本發現所述的方法可從眾多候選化合物中篩選出抑制這些解毒酶基因轉錄的殺蟲增效劑。

技術領域

本發明屬于植物保護與生物技術領域，具體涉及害蟲解毒酶基因的轉錄調控，以及抑制害蟲解毒酶基因轉錄的農藥增效技術。

技術背景

農業生產上使用農藥是防治農作物病蟲草害的最主要措施，但農藥長期不斷的重復使用，給農田有害生物施加持續的篩選壓力，造成有害生物的適應性微進化，有害生物進化產生抗藥性，使農藥的防治效果下降，甚至防治失效，嚴重影響有害生物的防治效果與農業生產的可持續性，甚至威脅糧食安全與人民健康。因此，有害生物的抗藥性治理是當前植物保護領域面臨的嚴峻現實問題，需要有創新性的技術來解決當前面臨的這一困局。

過去，對于有害生物的抗藥性治理，主要依賴農藥的合理輪換使用、合理混用以及采用增效劑來進行治理。農藥的輪換使用與混用的原理主要是轉換藥劑的攻擊靶標，降低藥劑篩選對有害生物造成的選擇壓力，從而達到延緩抗藥性發展的目的，屬于預防性抗性治理。但預防性抗性治理的措施不能用于已產生抗性的有害生物種群。而當前許多主要農作物害蟲對常用農藥品種均已產生抗藥性，如水稻褐飛虱已對吡蟲啉、噻螓酮、吡蚜酮等最常用的藥劑均已產生高水平的抗藥性。蔬菜上的小菜蛾、甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、煙粉虱等對常用藥劑均已產生抗藥性。目前，這種有害生物對多種藥劑產生抗性的多藥抗性現象已相當普遍，造成這些抗性害蟲已無藥可治的局面。增效劑的使用雖然也是抗性治理措施之一，如增效醚通過抑制細胞色素P450解毒酶的活性，降低有害生物的解毒代謝能力，對抗性害蟲有一定的增效作用，由于傳統的增效劑僅能針對某特定類型的解毒酶，而具備多藥抗性的害蟲種群往往是由于多種解毒酶的活性升高所致，因此，傳統的增效技術并不能解決生產上的多藥抗性問題。

近年來，對有害生物抗藥性機制的深入了解給解決抗性問題帶來了可能性。有害生物的多藥抗性主要是由于害蟲體內解毒酶基因表達上調，害蟲體內解毒酶活性升高，具備迅速地降解藥劑、使藥劑失活的能力，害蟲因而得以生存下來。害蟲體內解毒酶有許多類型，如細胞色素P450、酯酶、谷胱甘肽-S-轉移酶、轉運蛋白以及糖基轉移酶等。這些解毒酶基因在抗性害蟲體內的上調表達往往受特定信號通路與轉錄因子的調控，如抗氧化信號通路、激酶信號通路、轉錄因子CncC、轉錄因子AhR等。若能人為地調控這些信號通路或轉錄因子，將可干擾害蟲體內解毒基因的上調表達，從而下調害蟲體內解毒酶的活性，克服抗藥性，恢復抗性害蟲對藥劑的敏感性，提高藥劑的防治效果。

發明內容

本發明介紹了通過克隆解毒酶基因的上游調控序列，構建調控序列的熒光報告質粒，利用報告質粒進行轉錄抑制劑篩選的方法，以及所選出的抑制劑作為殺蟲增效劑的應用。具體來說本發明通過以下技術方案達到發明目的，包括以下主要步驟：

一、克隆CYP基因的上游調控序列