[發明專利]公共引物介導的多重定量PCR檢測技術在轉基因大豆檢測中的應用

在審

• 申請號: 202110303536.0
• 申請日: 2021-03-22
• 公開（公告）號: CN112760413A
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發明（設計）人: 孫萬平;張玲;錢利祥;丁威;方壇芬;韓蓉
• 申請（專利權）人: 蘇州大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851;C12N15/11
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 孫周強;陶海鋒

本發明公開了公共引物介導的多重定量PCR檢測技術在轉基因大豆檢測中的應用，具體檢測我國農業農村部允許進口的6種轉基因大豆。在每對特異性引物的5’^,端均加上一段公共引物,形成特異性嵌合引物。多重PCR檢測體系擴增出特異性片段，GeXP檢出各轉基因大豆片段長度，GeXP多重檢測體系檢測敏感性可達到為1 ng/μL;擴增產物測序結果進一步說明了引物擴增的特異性。本發明建立的基于GeXP系統的多重PCR定量檢測技術,可以準確鑒別6種轉基因大豆,為轉基因大豆及其他轉基因產品提供了新型的檢測方法。

技術領域

本發明屬于轉基因大豆檢測技術，具體涉及公共引物介導的多重定量PCR檢測技術研究及在轉基因大豆檢測中的應用。

背景技術

轉基因食品的安全問題一直是社會的熱點問題, 建立一種能夠鑒別這些轉基因食品的高通量檢測方法對消費者的知情權具有重要的意義。核酸檢測是轉基因食品檢測的主要技術和未來發展的必然趨勢, 食品核酸檢測技術主要包括PCR系列技術(如單重PCR、多重PCR及熒光定量PCR等)、數字PCR技術、Southern雜交、恒溫擴增技術、基因芯片技術及高通量測序等。由于受檢食品成分不明確, 目前針對食品核酸檢測技術主要采用多重PCR、熒光定量PCR、基因芯片和高通量測序技術。熒光定量PCR技術因熒光檢測通道限制, 檢測靶標一般在6種以內。基因芯片技術及高通量測序主要應用于人體的基因診斷, 技術上可以應用于食品檢測, 但食品檢測收費低廉, 此技術難以滿足食品經濟、快速的檢測需求。目前, 多重PCR因在一個PCR管中同時檢測多個靶標分子, 具有高效性、敏感性、經濟和簡便性等優點, 在食品安全核酸檢測技術中受到廣泛關注。然而該技術目前主要用于定性分析, 難以進行定量檢測。

發明內容

本發明將多重PCR擴增與GeXP高通量檢測結合起來, 在傳統PCR的基礎上引入熒光標記的公共引物, 在特異性引物與模板結合后, 公共引物與特異性引物結合合成新鏈,并作為新的模板鏈進行擴增。若干個循環之后, 擴增后的產物均帶上了熒光標記。通過GeXP系統所提供的DNA Standard Size可獲得產物的bp數大小, 對檢測樣品定性分析; 通過GeXP檢測產物熒光信號強度, 如建立標準曲線, 可實現對檢測樣品的相對含量測定,實現定量分析, 目前關于此方面的研究相對較少。

本發明采用如下技術方案：

公共引物介導的多重定量PCR檢測技術研究及在轉基因大豆檢測中的應用，提取待檢測產品基因組DNA作為模板，在嵌合引物與熒光公共引物存在下采用兩步退火溫度法進行PCR反應，對PCR產物進行GeXP系統檢測即完成產品中轉基因大豆成分的檢測。

本發明公開了利用公共引物介導的多重定量PCR檢測技術進行產品中轉基因大豆成分檢測的方法，包括以下步驟，提取待檢測產品基因組DNA作為模板，在嵌合引物與熒光公共引物存在下采用兩步退火溫度法進行PCR反應，對PCR產物進行GeXP系統檢測即完成產品中轉基因大豆成分的檢測。

本發明公開了嵌合引物與熒光公共引物在多重定量PCR檢測產品中轉基因大豆成份中的應用。

本發明中，所述公共引物的序列為SEQ ID NO.1，在其5’端進行Cy5熒光染料標記；所述嵌合引物為SEQ ID NO.2至SEQ ID NO.13。

本發明中，轉基因大豆的品種為MON7701、DP356043、CV-127、MON87769、MON87705和MON87708。