[發明專利]非洲豬瘟病毒的引物組合、試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 202110302520.8
• 申請日: 2021-03-22
• 公開（公告）號: CN113025751A
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 張蓉;沈俊杰;凌勇;龍毅;張志剛;吳有林
• 申請（專利權）人: 福建傲農生物科技集團股份有限公司;泰和縣傲牧育種有限公司;廣西柯新源原種豬有限責任公司;廈門銀祥集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 許耀

1.一種非洲豬瘟病毒的引物組合，其特征在于，包括：

上游引物ASFV-MF：5’-TCAGTATCCATTCCCTTCG-3’；

下游引物ASFV-MR：5’-TTGTGCCAATCTCGGTGT-3’。

2.一種非洲豬瘟病毒的試劑盒，其特征在于，含有權利要求1所述的引物組合，記為PCRMix。

3.根據權利要求2所述的非洲豬瘟病毒的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括：陽性對照、陰性對照和PCR擴增液。

4.根據權利要求2或3所述的非洲豬瘟病毒的試劑盒，其特征在于，所述的PCR Mix中，上游引物ASFV-MF與下游引物ASFV-MR的摩爾比為1:1。

5.根據權利要求3所述的非洲豬瘟病毒的試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照為含有428bp的ASFV基因序列的重組質粒。

6.根據權利要求3所述的非洲豬瘟病毒的試劑盒，其特征在于，所述的陰性對照為雙蒸水。

7.根據權利要求3所述的非洲豬瘟病毒的試劑盒，其特征在于，所述的PCR擴增液包括Taq PCR Mix(2×)。

8.如權利要求2～7任一所述的非洲豬瘟病毒的試劑盒的應用，其特征在于，將其應用于檢測非洲豬瘟病毒，包括以下方法：

S1：提取待測樣品的總DNA備用；

S2：配制反應體系：取樣品DNA、PCR Mix和PCR擴增液，并用雙蒸水定容至一定體積，配置得到反應體系；

S3：擴增程序：進行PCR擴增；

S4：瓊脂糖凝膠電泳：在溶解的瓊脂糖凝膠中，加入核酸染料輕輕搖勻，在電泳槽內放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后取PCR擴增產物，點樣于瓊脂糖凝膠孔中，進行電泳，待Marker和條帶都跑開后，由凝膠成像儀觀察并拍照，獲得檢測結果；

S5：參照待測樣品對陽性對照和陰性對照進行處理；

S6：結果判斷。

9.根據權利要求8所述的非洲豬瘟病毒的試劑盒的應用，其特征在于，步驟S6中：陽性對照出現428bp擴增條帶，陰性對照無條帶出現時，實驗結果成立，待測樣品出現428bp的擴增條帶為非洲豬瘟病毒核酸陽性，否則為陰性。

10.根據權利要求8所述的非洲豬瘟病毒的試劑盒的應用，其特征在于，包括以下條件中的任一項或多項：

(i)步驟S2中，取樣品DNA 2μL，PCR Mix 2μL，PCR擴增液12.5μL，加入雙蒸水10.5μL，配置25μL反應體系；

(ii)步驟S3中，擴增程序包括：94℃5min，循環94℃30s，55℃30s，72℃1min，共計35個循環，再72℃延伸10min；

(iii)步驟S4中，用1g瓊脂糖放入100mL TAE中，得到1％的瓊脂糖凝膠，于微波爐中溶解，再加入5μL的核酸染料輕輕搖勻，在電泳槽內放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后取10μL PCR擴增產物，點樣于瓊脂糖凝膠孔中，以110-120V電壓于TAE電泳緩沖液中電泳，待Marker和條帶都跑開后，由凝膠成像儀觀察并拍照，獲得檢測結果。