[發明專利]一種禽流感殼聚糖納米顆粒疫苗的制備方法

在審

• 申請號: 202110302260.4
• 申請日: 2021-03-22
• 公開（公告）號: CN113117066A
• 公開（公告）日: 2021-07-16
• 發明（設計）人: 孫海亮;潘亮奇;廖明
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: A61K39/145
• 分類號: A61K39/145;A61K9/51;A61K47/36;A61K47/02;A61P31/16
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 李英杰

本發明涉及生物制品技術領域，具體涉及一種禽流感殼聚糖納米顆粒疫苗的制備方法，包括以下步驟：S1.制備殼聚糖溶液和三聚磷酸鈉溶液；S2.制備滅活病毒液；S3.將滅活病毒液逐滴滴加至殼聚糖溶液中得到病毒/殼聚糖混合溶液；再以0.1～0.5mL/min的流速，在不斷以800～1500rpm/min的轉速攪拌的條件下，將三聚磷酸鈉溶液加入到所述病毒/殼聚糖混合溶液中。本發明在預防H9N2禽流感方面有很大潛力，有望作為一種新型納米疫苗應用于臨床，具有良好的疫苗開發潛力。另外，本發明提供的方法能夠應用于更廣大的范圍，可以選擇不同的病毒種類，或將某病毒進行基因工程改造，從而利用其抗原區域進行疫苗的制備。

技術領域

本發明涉及生物制品技術領域，具體涉及一種禽流感殼聚糖納米顆粒疫苗的制備方法。

背景技術

禽流感是一種由甲型流感病毒引起的禽類高發性疾病，以精神沉郁，食欲減退，咳嗽、噴嚏等呼吸道癥狀為主要臨床癥狀。目前，H9N2引起的禽流感在我國呈地方流行，雖然死亡率低，但感染的蛋雞容易出現輸卵管功能異常，產褪色蛋、畸形蛋、砂皮蛋、軟殼蛋，雞群產蛋率下降30％～80％，病程持續時間長的可達月余，造成嚴重的經濟損失。近幾年我國也接連發生，給養禽業造成了巨大的經濟損失。疫苗接種仍然是當前預防和控制H9N2禽流感的主要手段，而納米顆粒是指粒子直徑大小在1～1000nm之間的微小顆粒。因其本身物理和生物學的特性，使其廣泛應用到食品、化工、檢測、紡織與機械、生物醫學等方面。納米顆粒經過精密加工，不僅能夠被設計成病毒自然的形態(病毒樣顆粒)，還能夠同時裝載多種抗原，因此納米顆粒在疫苗方面的應用前景廣闊。

傳統禽流感疫苗一般分為三種，滅活疫苗、弱毒活疫苗和基因工程疫苗。傳統疫苗存在一定的局限性，如減毒活疫苗可能出現“毒力返祖”的情況，滅活疫苗產生免疫力的持續時間短，質粒DNA疫苗可能整合到免疫動物染色體，免疫應激反應劇烈等。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中減毒活疫苗可能出現“毒力返祖”的情況，滅活疫苗產生免疫力的持續時間短，質粒DNA疫苗可能整合到免疫動物染色體，免疫應激反應劇烈等問題，提供一種禽流感殼聚糖納米顆粒疫苗的制備方法。

本發明的目的通過以下技術方案予以實現：

一種禽流感殼聚糖納米顆粒疫苗的制備方法，包括以下步驟：

S1.制備殼聚糖溶液和三聚磷酸鈉溶液；

S2.制備滅活病毒液；

S3.將滅活病毒液逐滴滴加至殼聚糖溶液中得到病毒/殼聚糖混合溶液；再以0.1～0.5mL/min的流速，在不斷以800～1500rpm/min的轉速攪拌的條件下，將三聚磷酸鈉溶液加入到所述病毒/殼聚糖混合溶液中；

S4.在1～8℃條件下，將步驟S3的最后得到的混合溶液，以8000～13000g/min的轉速離心20～50min得到殼聚糖-禽流感納米顆粒；將得到的殼聚糖-禽流感納米顆粒分散在磷酸緩沖溶液中。

殼聚糖溶液的配制：將殼聚糖固體顆粒溶解在2％的乙酸水溶液中直至溶液透明，并不斷用磁力攪拌器攪拌直至完全溶解。溶解后，將殼聚糖溶液用去離子水稀釋，用NaOH將溶液的pH調節至5.4。再將溶液通過0.22μm過濾器過濾，得到用于實驗的殼聚糖溶液。

三聚磷酸鈉溶液的配制：將三聚磷酸鈉固體顆粒溶解在去離子水中，并不斷用磁力攪拌器攪拌直至完全溶解。再用0.22μm過濾器過濾，得到用于實驗的三聚磷酸鈉溶液。

根據離子交聯的原理，帶正電的殼聚糖和帶負電的三聚磷酸鈉之間的分子內和分子間作用力交聯形成納米顆粒。

優選地，所述步驟S1中，殼聚糖溶液的濃度為0.5％～2％(w/v)；所述三聚磷酸鈉的濃度為0.5％～1.5％(w/v)。