[發明專利]一種綠色熒光蛋白標記月季鐮刀菌的制備方法及應用

在審

• 申請號: 202110301234.X
• 申請日: 2021-03-22
• 公開（公告）號: CN113005136A
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 何姣;黃麟;潘玉婷;張云昭;王俊偉;李建偉
• 申請（專利權）人: 南京林業大學
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N15/65;C40B50/06;G01N21/64;C12R1/77
• 代理公司: 南京燦爛知識產權代理有限公司 32356
• 代理人: 李志鴻

本發明屬于植物病理學領域，提供一種綠色熒光蛋白標記月季鐮刀菌的制備方法及應用，以月季鐮刀菌菌株YJ1為轉化體，利用PEG介導原生質體的遺傳轉化方法將綠色熒光蛋白基因標記月季鐮刀菌菌株YJ1，獲得標記綠色熒光蛋白的月季鐮刀菌菌株YJ1?GFP，可用于月季鐮刀菌菌株突變體庫的構建，篩選、寄主抗性定量鑒定、寄主對月季鐮刀菌菌株侵染的響應機制及月季鐮刀菌菌株侵染和致病機理研究。本發明提供的提供一種綠色熒光蛋白標記月季鐮刀菌的制備方法，快速方便，步驟簡化，耗時短，能直接在平板上挑取綠色熒光蛋白標記的月季鐮刀菌菌株YJ1?GFP。

技術領域

本發明屬于植物病理學技術領域，具體涉及一種綠色熒光蛋白標記月季鐮刀菌的制備方法及應用。

背景技術

月季枯萎病是由月季鐮刀菌(Fusarium rosicola sp.nov.)引起的維管束系統性真菌病害，該菌可侵染月季根莖葉各個部位，病害癥狀前期葉片褪綠變黃，逐漸脫落，最后造成月季整株枯死。月季鐮刀菌寄主范圍廣泛，可危害薔薇科的月季、玫瑰、薔薇和櫻花等多種花卉。冬春日光溫室及早春、秋后大棚栽培均有發生，且危害極其嚴重。要獲得抗病品種，首先要了解月季鐮刀菌的分子遺傳基礎和致病機制，目前國內外對于月季枯萎病的病原菌的鑒定，類群分析研究已取得了一些進展，但缺乏對月季鐮刀菌致病機理的認識。

穩定表達綠色熒光蛋白標記月季鐮刀菌對于研究月季鐮刀菌致病相關基因、侵染過程和致病機理，對于研究月季鐮刀菌侵染致病過程的組織學研究和月季鐮刀菌致病相關基因、病原菌與寄主互作以及病原菌的功能基因組學研究奠定基礎，同時，為月季枯萎病的控制和月季抗枯萎病抗病育種材料獲得提供理論基礎。然而，目前，國內外已有利用不同遺傳轉化方法轉化綠色熒光蛋白標記(GFP)真菌的報道，但已報道的GFP標記真菌菌株方法或未涉及具體標記相關細節，或標記轉化步驟繁瑣，效率低下，熒光強度不穩定。目前還沒有可參考的月季枯萎病病原菌月季鐮刀菌GFP標記菌株及方法的報道，這已經成為月季枯萎病菌侵染致病過程與機理研究的瓶頸。因此，急需獲得穩定表達綠色熒光蛋白標記月季鐮刀菌及方法。

發明內容

本發明提供一種綠色熒光蛋白標記月季鐮刀菌的制備方法及應用，以月季鐮刀菌菌株YJ1為轉化體，利用PEG介導原生質體的遺傳轉化方法將綠色熒光蛋白基因標記月季鐮刀菌菌株YJ1，獲得標記綠色熒光蛋白的月季鐮刀菌菌株YJ1-GFP，可用于月季鐮刀菌菌株突變體庫的構建，篩選、寄主抗性定量鑒定、寄主對月季鐮刀菌菌株侵染的響應機制及月季鐮刀菌菌株侵染和致病機理研究。

本發明所使用的月季鐮刀菌(Fusarium rosicolasp.nov.)YJ1，于2020年11月14日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏地址為中國.武漢.武漢大學，其保藏編號是CCTCC No:AF2020053^T。

上述的月季鐮刀菌(Fusarium rosicolasp.nov.)YJ1通過以下步驟篩選得到：

本實驗于2020年6月在中國江蘇省南京市浦口區發現了大面積的月季枯萎病，采集月季感病莖段，經過2-3天保濕培養，觀察到大量的白色菌絲布滿在莖段維管束內；用滅菌的接種針隨機挑取白色菌絲接種到PDA培養基上，28℃培養，培養3天后，利用無菌挑針挑取菌落邊緣部分接種至新的PDA平板上對菌株進行純化，得到純化菌株并編號為YJ1。經形態學描述和系統發育學分析，將其鑒定為新種并命名為Fusarium rosicolasp.nov.。

本發明的目的之一是提供一種綠色熒光蛋白標記月季鐮刀菌的制備方法，包括以下步驟：

S1制備月季鐮刀菌分生孢子液

月季鐮刀菌為月季鐮刀菌菌株YJ1，將月季鐮刀菌YJ1在馬鈴薯固體培養基上培養4d后，使用無菌手術刀刮取30～40塊規格為2×2mm的月季鐮刀菌YJ1菌絲塊，接種至CMC液體培養基中，置于暗室搖床上，250rmp、25℃搖72h,用兩層濾膜過濾收集孢子于50mL離心管中，4000rpm，離心10min，棄廢液，獲得分生孢子液；