[發明專利]一種多級純化核酸酶P1的方法

有效

• 申請號: 202110301199.1
• 申請日: 2021-03-22
• 公開（公告）號: CN112760309B
• 公開（公告）日: 2022-05-17
• 發明（設計）人: 陳曉春;張磊;湯亦文;李梓陽;蔡家棟
• 申請（專利權）人: 南京工業大學;南京同凱兆業生物技術有限責任公司
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12R1/80
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 仲凌霞;肖明芳

本發明公開了一種多級純化核酸酶P1的方法，即將核酸酶P1粗酶液經超濾膜超濾、熱滅活和樹脂除雜進行多級純化。本發明方法能夠高效的分離純化核酸酶P1，核酸酶P1的酶回收率達82.6％；而且成本低廉、可適用于大規模產業化生產。同時，本發明方法所獲得的核酸酶P1純度大大提高，比活為粗酶液的7.3倍，雜質少，所以可用于食品工業。

技術領域

本發明涉及生物領域，具體涉及一種多級純化核酸酶P1的方法。

背景技術

隨著生物技術產業和制藥工業的發展，核苷酸及其衍生物的研究和開發成為熱點，并逐漸形成了繼氨基酸之后的又一重大產業。核苷酸是一類具有高附加值的生化物質，用途十分廣闊，支撐一些較大產業的發展，如高端乳業、醫藥行業等。在乳業中作為功能性添加劑，它的加入能使奶粉更接近于母乳，能夠有效增強嬰幼兒抵抗細菌性痢疾的能力，減少腹瀉的發生；在醫藥領域，核苷酸作為醫藥中間體是許多核苷酸類衍生物的生產原料，用于合成如CDP、UDP、GTP、CDP-膽堿、SAM、cGMP、CTP、UTP、cAMP、UDP-乙酰葡糖胺、GDP-甘露糖、GDP-葡萄糖、UDP-葡萄糖類等上百種化合物。核苷酸類藥物在抗癌、抗病毒、治療心血管疾病、糖尿病及干擾誘導等方面具有獨特的療效，有著良好的應用效果和巨大的應用市場。

在酶解法制備核苷酸中所需的酶是核酸酶Pl，它是一種能夠水解RNA獲得四種5'-核苷酸的磷酸二酯酶，其酶解產物雜質少后續分離工藝簡單，國外一般采用該方法進行核苷酸的生產。但是核酸酶P1粗酶含有較多雜酶，對于酶解的效率影響較大，一般需要進行純化后使用。

目前采用硫酸銨鹽析法、離心噴霧干燥法等分離核酸酶P1的方法存在樣品回收率低、分離材料或設備昂貴、樣品處理量小、單一方法分離純度低的問題；而且經硫酸銨鹽析法分離方法得到的核酸酶P1含有較多雜質，效價低，且不能直接應用于食品工業中。

發明內容

發明目的：本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種多級純化核酸酶P1的方法。

為了解決上述技術問題，本發明公開了一種多級純化核酸酶P1的方法，將核酸酶P1粗酶液經超濾膜超濾、熱滅活和樹脂除雜進行多級純化。

優選地，如圖1所示，將核酸酶P1粗酶液依次經超濾膜超濾、熱滅活和樹脂除雜進行多級純化。

具體地，包括如下步驟：

(1)將核酸酶P1粗酶液經超濾膜超濾，收集截留液；

(2)將步驟(1)所得截留液進行熱滅活，固液分離，收集濾液；

(3)將步驟(2)所得濾液上樣至樹脂中除雜，收集流出液，即為多級純化后的核酸酶P1溶液。

步驟(1)中，所述核酸酶P1粗酶液為桔青霉發酵所制得的，除了核酸酶P1外還含有其他蛋白酶，如：堿性磷酸酶，淀粉酶等，雜質占總蛋白含量的30％左右。

其中，所述的桔青霉(Penicillium citrinum)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.2014。

其中，所述核酸酶粗酶液中核酸酶P1的酶活為5000-7000U/mL。

其中，所述核酸酶粗酶液中核酸酶P1的比活為800-1000U/g。

優選地，將核酸酶P1粗酶液先固液分離，收集濾液，再對所述濾液進行多級純化。

步驟(1)中，所述超濾膜為聚醚砜膜。

步驟(1)中，所述超濾膜的分子量為1-30KDa，優選為2-20KDa，進一步優選為5-15KDa。

步驟(1)中，所述超濾包括如下步驟：