[發(fā)明專利]小鼠耳蝸螺旋器貼壁培養(yǎng)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110301117.3
• 申請日: 2021-03-22
• 公開（公告）號: CN113005087B
• 公開（公告）日: 2022-05-03
• 發(fā)明（設計）人: 段繼峰;丁澤陽;賈玉蓮
• 申請（專利權）人: 澎立生物醫(yī)藥技術（上海）股份有限公司
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權代理有限公司 11245
• 代理人: 陸惠中;王永偉

1.一種小鼠耳蝸螺旋器的體外貼壁培養(yǎng)方法，其特征在于，包含如下步驟：

(1)將小鼠斷頸后剪開耳廓皮膚，順外耳道挑除聽泡，取出耳蝸，獲得帶前庭底座的小鼠耳蝸；

(2)去除耳蝸頂后側及頂轉薄層骨壁，得到去除局部骨壁后的耳蝸，由耳蝸頂轉至底轉剝除耳蝸表面骨壁，可得去除外周骨質(zhì)耳蝸膜迷路；

(3)去除螺旋韌帶、血管紋、蓋膜周邊組織，去除耳蝸蝸軸的螺旋神經(jīng)節(jié)，沿蝸頂螺旋向下，分段分離出基底膜，即得包含螺旋器的基底膜；

(4)培養(yǎng)：鼠尾膠以0.02mol/L的醋酸稀釋50倍，與100μg/ml多聚鳥氨酸等體積混合，混合均勻，取適量加入到35mm培養(yǎng)皿中，使其淹沒整個培養(yǎng)皿，然后在培養(yǎng)箱內(nèi)放置1小時后，吸干培養(yǎng)皿內(nèi)液體，再以PBS沖洗，自然晾干，備用；取適量無血清培養(yǎng)液加入到包被好的培養(yǎng)皿中，將步驟(3)分離得到的小鼠耳蝸基底膜移入，使其網(wǎng)狀面朝上且平鋪，下沉到培養(yǎng)皿底部，最后將培養(yǎng)皿緩慢移入37℃， 5％CO₂培養(yǎng)箱，進行培養(yǎng)，次日補加適量包含終濃度為5mM的TSP-1補料培養(yǎng)基，以后隔日更換補料培養(yǎng)基，總計培養(yǎng)10天；

步驟(4)中所述補料培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)液，添加體積百分比為1％的N2補料，體積百分比為2％的B27補料，以及終濃度為50μg/ml的氨芐青霉素和終濃度為5mM的TSP-1；

步驟(4)中所述無血清培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)液，添加體積百分比為1％的N2補料，體積百分比為2％的B27補料，以及終濃度為50μg/ml的氨芐青霉素。

2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述小鼠是出生后3-5天的新生小鼠。

3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)在解剖顯微鏡下進行。

4.根據(jù)權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，所述方法在耳蝸螺旋器的培養(yǎng)階段，采用免疫染色標記Myo7a方法觀察耳蝸基底膜螺旋器組織以及毛細胞活性。

5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述免疫染色標記Myo7a方法包括：

1)將培養(yǎng)的耳蝸螺旋器移除培養(yǎng)液，加入2ml 4％的福爾馬林固定液，室溫放置15分鐘后用PBS洗去；

2)加入2ml 0.1％的PBS配制的Triton x-100溶液，室溫放置15分鐘后用PBS洗去；

3)加入2ml 2.5％的PBS配制的BSA溶液，室溫放置30分鐘后用PBS洗去；

4)一抗孵育，其為Rabbit anti-Myo7a 1:200，2.5％BSA于PBS中，4℃過夜；

5)用PBS洗去一抗，加入二抗，其為Alexa Fluor 546goat-anti Rabbit IgG1:1000,2.5％BSA于PBS中，室溫放置2小時；

6)用PBS洗去二抗，后用熒光顯微鏡進行觀察、拍照。