[發明專利]一種檢測酪氨酸酶活性的方法

在審

• 申請號: 202110300784.X
• 申請日: 2021-03-22
• 公開（公告）號: CN113295658A
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發明（設計）人: 李高;蔡永其
• 申請（專利權）人: 閩江學院
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 福州旭辰知識產權代理事務所(普通合伙) 35233
• 代理人: 程春寶

本發明公開了一種不需要標記、不需要復雜合成、利用常見化合物的組合來檢測酪氨酸酶活性的熒光方法。將葫蘆[8]脲(CB[8])、硫黃素T(ThT)和多肽YLA或Dopa?LA三者按比例簡單混合，即可用于檢測酪氨酸酶的活性。具體而言，在CB[8]?ThT?YLA/Dopa?LA溶液中加入不同濃度的酪氨酸酶溶液，在激發波長為417 nm、發射波長為570 nm下進行熒光測量，得到熒光信號隨時間變化的曲線，進一步推算出酶反應速率與酶濃度關系，經簡單線性擬合即可定量檢測酪氨酸酶濃度。本發明的方法不需要合成復雜的熒光分子或材料，且可以對酪氨酸酶的活性進行連續監測，應用前景廣闊。

技術領域

本發明屬于分析化學領域，具體涉及一種酪氨酸酶活性的熒光檢測方法。

背景技術

酪氨酸酶是一種含銅金屬氧化還原酶，在微生物、動物、植物和人體中都有分布，其在黑色素的代謝過程中起到很重要的作用。酪氨酸酶可以催化酪氨酸轉變為多巴，然后氧化多巴形成多巴醌，多巴醌在生物體內經過一系列反應后，可以形成黑色素。酪氨酸酶活性過高或缺失，都會影響黑色素的產生，進而可能引起雀斑、褐斑、皮膚癌、白癜風、白化病、黑色素瘤等疾病。因此，開發酪氨酸酶活性檢測方法具有重要意義。

由于酪氨酸酶的底物是酪氨酸、多巴等含酚羥基的分子，目前使用的熒光探針多數是酚類衍生物或者含酚類衍生物的材料，大部分需要進行相對復雜的化學合成。本發明中使用的大環分子葫蘆[8]脲(CB[8])、熒光分子硫黃素-T (ThT)和多肽YLA或Dopa-LA均是可以購買得到的，不需要經過復雜的合成。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用熒光來檢測酪氨酸酶活性的方法。該方法不需要標記、不需要合成復雜的熒光分子或材料，且可以對酪氨酸酶的活性進行連續監測，應用前景廣闊。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

1.CB[8]-ThT-YLA/Dopa-LA體系

將多肽YLA或Dopa-LA與ThT、CB[8]以不同摩爾比在緩沖液中均勻混合，孵育適當時間后，在激發波長417 nm、發射波長450 nm - 699 nm下進行光譜掃描，同時測定激發波長為417 nm、發射波長為570 nm的熒光信號值。

2.酪氨酸酶活性的檢測

將CB[8]、ThT和YLA/Dopa-LA以特定摩爾比在緩沖液中均勻混合后恒溫孵育一定時間，把不同濃度酪氨酸酶溶液加入上述體系，在激發波長417 nm、發射波長570 nm下進行持續熒光測量，每隔1 min測一次。根據熒光信號隨時間變化的曲線，可以算出酶催化反應的速率，經線性擬合發現速率與酶濃度成正比，表明該方法可用于測定酪氨酸酶活性。

3.曲酸抑制酪氨酸酶活性的檢測

將酪氨酸酶與不同濃度的抑制劑分子恒溫孵育一定時間后，加入特定摩爾比的CB[8]-ThT-YLA/Dopa-LA溶液；在激發波長為417 nm、發射波長為570 nm下進行熒光信號強度測定，同樣每隔1 min測一次。根據熒光信號隨時間變化的曲線，可以算出酶催化反應的速率與抑制劑濃度的關系，進一步的可以計算出抑制劑的IC50值。

本發明的檢測原理：ThT分子可以與CB[8]結合，且結合后熒光信號會增強；多肽YLA或Dopa-LA也可以結合CB[8]，那么在CB[8]-ThT-YLA/Dopa-LA的三元體系中，若多肽濃度較高，則ThT與CB[8]結合較少，其熒光信號增強的幅度會降低；在酪氨酸酶的作用下多肽YLA/Dopa-LA會被氧化成復雜產物，這些產物與CB[8]結合力很弱，因此ThT與CB[8]的結合會變多，熒光信號會增強。據此，我們根據CB[8]-ThT-YLA/Dopa-LA這個三元體系在加入酪氨酸酶后熒光信號增強的快慢，即可測定酪氨酸酶的活性。

本發明的有益效果在于：本發明建立的基于CB[8]-熒光分子-多肽的三元體系，能快速、準確地實現對酪氨酸酶活性進行連續監測；整個操作過程非常簡單，無需任何修飾和標記，成本低廉，具有較強的應用性。