[發(fā)明專利]CsSH1基因在提高黃瓜苗期耐徒長中的應(yīng)用和方法

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• 申請日: 2021-03-19
• 公開（公告）號: CN115125252A
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李季;陳勁楓;伍若彤
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/113;C12N15/84;C12N15/55;A01H5/00;A01H5/04;A01H5/12;A01H6/34
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本發(fā)明涉及CsSH1基因在提高黃瓜苗期耐徒長中的應(yīng)用，通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯CsSH1基因，使CsSH1基因功能失活來提高黃瓜苗期的耐徒長性。本發(fā)明的有益效果在于：(1)利用基因編輯技術(shù)獲得耐徒長的黃瓜植株，較傳統(tǒng)的育種方法更經(jīng)濟(jì)、有效，是一種創(chuàng)建抗性材料的好方法，大大縮短了育種年限；(2)提供了耐徒長的黃瓜基因編輯植株，為選育苗期耐徒長黃瓜雜交種提供了新的育種材料。

一、技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯CsSH1基因，進(jìn)而獲得苗期耐徒長黃瓜的黃瓜品種。

二、背景技術(shù)

黃瓜是重要的蔬菜作物。中國的黃瓜種植面積、產(chǎn)量和人均年消費量均居世界首位。我國黃瓜生產(chǎn)以設(shè)施栽培為主，基本實現(xiàn)了周年供應(yīng)。在生產(chǎn)過程中，培育壯苗是黃瓜生產(chǎn)中防治病蟲害，獲得高產(chǎn)的基礎(chǔ)，但由于秋冬茬育苗期(7-8月)的高溫高濕，越冬茬和冬春茬育苗期(11月后)的光照不足等氣候因素，經(jīng)常造成秧苗徒長問題。徒長黃瓜幼苗莖稈纖細(xì)、節(jié)間長、葉片薄而色淡，這種秧苗根系弱小，抗性差，栽植后緩苗期長，成活率低，很難獲得早熟與豐產(chǎn)。加強保護(hù)地內(nèi)的溫、濕、光照和水肥管理，甚至使用一些激素類制劑能夠在一定程度上防治黃瓜幼苗徒長，但偶遇極端氣候就會造成生產(chǎn)問題，同時增加了生產(chǎn)成本。因此，培育苗期耐徒長的黃瓜品種是徹底解決黃瓜育苗徒長問題的最佳途徑。

發(fā)明人團(tuán)隊在前期研究發(fā)現(xiàn)，源自我國云南省西雙版納地區(qū)的半野生資源材料西雙版納黃瓜(Cucumis sativus L.var.xishuangbannanesis Qi et Yuan)表現(xiàn)為苗期下胚軸短、耐徒長的特點。發(fā)明人團(tuán)隊前期研究通過利用西雙版納黃瓜自交系(SWCC8)和栽培黃瓜自交系‘北京截頭’(CC3)構(gòu)建了遺傳定位群體，進(jìn)一步通過構(gòu)建遺傳圖譜結(jié)合基因組重測序，完成了西雙版納黃瓜短下胚軸基因CsSH1的圖位克隆，并研究發(fā)現(xiàn)該基因的突變是導(dǎo)致黃瓜幼苗下胚軸矮壯、耐徒長的原因(Bo等，SHORT HYPOCOTYL1 Encodes a SMARCA3-Like Chromatin Remodeling Factor Regulating Elongation，Plant Physiology，2016)。CsSH1是一個極具商業(yè)價值的農(nóng)藝性狀基因，然而由于傳統(tǒng)育種方法效率較低，CsSH1基因在黃瓜改良中應(yīng)用不足。

基因編輯技術(shù)是利用靶向性的序列特異核酸酶對基因組進(jìn)行定點突變或精準(zhǔn)修飾的技術(shù)，其中CRISPR/Cas系統(tǒng)是一種具有核酸內(nèi)切酶活性的復(fù)合體，識別特定的DNA序列，進(jìn)行特定位點切割造成雙鏈DNA斷裂，在沒有模板的條件下，發(fā)生非同源重組末端連接，造成移碼突變，導(dǎo)致基因敲除。這一技術(shù)由于能快速、簡便、高效地靶向基因組任何基因，從而引起了廣泛的關(guān)注，在基因功能研究與作物的遺傳改良中得到了廣泛應(yīng)用。目前隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)展完善，可以在基因組的特定位點產(chǎn)DNA雙鏈斷裂，實現(xiàn)基因敲除、定點插入或替換，可以定向的對植物基因組進(jìn)行編輯，并且通過后代的分離可已將含有轉(zhuǎn)基因成分的植株分離出去，達(dá)到精確快速改良品種的目的。

三、發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是解決不良栽培環(huán)境下黃瓜幼苗徒長的問題，提供一種培育耐徒長黃瓜的新方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種利用CRISPR/Cas系統(tǒng)編輯黃瓜CsSH1基因從而制備苗期耐徒長黃瓜的方法。

本發(fā)明所編輯的與黃瓜下胚軸發(fā)育相關(guān)的基因，名稱為CsSH1。CsSH1基因編碼一個RAD5同源蛋白，在DNA修復(fù)過程中發(fā)揮功能。在西雙版納黃瓜中CsSH1攜帶了一個罕見的變異位點，這個變異可能導(dǎo)致了基因功能的喪失，從而使黃瓜幼苗矮壯、耐徒長。所述黃瓜CsSH1基因的蛋白編碼區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

進(jìn)一步地，本發(fā)明分別在CsSH1基因第1外顯子處設(shè)計2個sgRNA位點，分別記為sgRNAexon1-1、sgRNAexon1-2，均位于該基因的第1個外顯子(見附圖1)，序列如下所示：