[發明專利]動物性食品中四種致病菌多重PCR快速檢測方法

在審

• 申請號: 202110299219.6
• 申請日: 2021-03-21
• 公開（公告）號: CN112877449A
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發明（設計）人: 鄧景致;潘百玲;李志江
• 申請（專利權）人: 黑龍江八一農墾大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/19;C12R1/01;C12R1/38
• 代理公司: 哈爾濱東方專利事務所 23118
• 代理人: 曹愛華

1.一種動物性食品中四種致病菌多重PCR快速檢測方法，其特征在于：在LB培養基通用增菌后的6h內一步同時檢測食品中污染的四種致病菌，四種致病菌為大腸埃希氏菌O157：H7、單核細胞增生李斯特氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌和熒光假單胞菌；具體包括如下步驟：

步驟一、樣品處理：

取待檢食品樣品1g或1mL加入到9 mL滅菌LB液體培養基中37℃，120r/min振蕩培養， 6h后，取1mL培養液用細菌基因組提取試劑盒提取DNA，作為多重PCR檢測模板；

步驟二、建立多重 PCR擴增的PCR反應體系：

2.1 PCR引物設計：PCR擴增菌特異靶基因的選用：大腸埃希氏菌O157：H7的緊密黏附素基因eaeA，單核細胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因hly，小腸結腸炎耶爾森氏菌的粘附侵襲位點基因ail，熒光假單胞菌的熱休克蛋白基因htpX；

根據大腸埃希氏菌O157：H7的緊密黏附素基因eaeA的特異位點設計兩條特異引物，并組成第一對引物：

上游引物eaeA-s2：CACCAGAGGAATCGGAGTA （SEQ ID NO:1）

下游引物eaeA-a2：CTGAAAGCGAAATGATGAAG （SEQ ID NO:2）

根據單核細胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因hly的特異位點設計兩條特異引物，并組成第二對引物：

上游引物hly-s1：TTCGGCAAAGCTGTTACTA （SEQ ID NO:3）

下游引物hly-a1：GGCAAATAGATGGACGATG （SEQ ID NO:4）

根據小腸結腸炎耶爾森氏菌的粘附侵襲位點基因ail的特異位點設計兩條特異引物，并組成第三對引物：

上游引物ail-s1：TGAAGTACCGTTATGAACTCG （SEQ ID NO:5）

下游引物ail-a1：TGACTTAACCTTTCCGTGAG （SEQ ID NO:6）

根據熒光假單胞菌的熱休克蛋白基因htpX的特異位點設計兩條特異引物，并組成第四對引物：

上游引物htpX-s1：TTCTGTGCGGTCTTTGGT （SEQ ID NO:7）

下游引物htpX-a1：AGGTAGTAGGCGATGC （SEQ ID NO:8）

2.2建立多重 PCR擴增的PCR反應體系：

多重PCR擴增PCR反應體系包括: 以50μL溶液計,5 μL 10×PCR反應緩沖液, 5μl 濃度為2mM 的dNTP， 5u/μL Taq酶1μL， 4μL多重PCR檢測模板，3 μL濃度為25mM 的MgCl₂，濃度為25uM的第一對上、下引物各為1μL，濃度為25uM的第二對上、下引物各為1μL，濃度為25uM的第三對上、下引物各為2μL，濃度為25uM的第一對上、下引物各為2μL，余量為超純水；

步驟三、多重PCR檢測：

將多重 PCR擴增的PCR反應體系進行PCR擴增反應，獲得PCR擴增產物，若PCR擴增產物中存在866bp的DNA片段，表明所述待檢食品中有大腸埃希氏菌；若PCR擴增產物中存在605bp的DNA片段，表明所述待檢食品中有單核細胞增生李斯特氏菌；若PCR擴增產物中存在461bp的DNA片段，表明所述待檢食品中有熒光假單胞菌；若PCR擴增產物中存在209bp的DNA片段，表明所述待檢食品中有小腸結腸炎耶爾森氏菌。

2.根據權利要求1所述的動物性食品中四種致病菌多重PCR快速檢測方法，其特征在于：所述PCR擴增反應的條件為：在PCR儀上進行擴增反應，反應熱循環參數為：94℃預變性4min，94℃變性45 s，56℃退火30s，72℃延伸50s，共35個循環，最后72℃延伸4 min。