[發(fā)明專利]一種利普斯他汀發(fā)酵方法與發(fā)酵培養(yǎng)基

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110298030.5
• 申請日: 2021-03-19
• 公開（公告）號: CN112852898B
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 郭霞凌;李輝
• 申請（專利權(quán)）人: 大邦（湖南）生物制藥有限公司
• 主分類號: C12P17/02
• 分類號: C12P17/02;C12N1/20;C12R1/465
• 代理公司: 深圳眾鼎匯成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44566
• 代理人: 張宏杰

為克服現(xiàn)有利普斯他汀發(fā)酵方法中發(fā)酵單位偏低、發(fā)酵原料成本高、工藝復(fù)雜難控、不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等問題，本發(fā)明提供了一種簡便高效的利普斯他汀發(fā)酵方法與發(fā)酵培養(yǎng)基，包括以下步驟：平皿分離與斜面培養(yǎng)、菌種斜面搖瓶發(fā)酵篩選、搖瓶種子液制備、一級種子罐培養(yǎng)、二級種子罐培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)。本發(fā)明通過搖瓶發(fā)酵篩選高產(chǎn)菌株、各級培養(yǎng)基優(yōu)化以及發(fā)酵過程工藝改進等組合優(yōu)化策略獲得的利普斯他汀發(fā)酵方法與發(fā)酵培養(yǎng)基，具有發(fā)酵單位高、發(fā)酵原料成本低、發(fā)酵過程控制簡單方便、無需添加外源毒性前體等優(yōu)勢，對于提高利普斯他汀發(fā)酵產(chǎn)量和產(chǎn)品質(zhì)量、降低生產(chǎn)成本均具有十分重要的意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利普斯他汀發(fā)酵方法與發(fā)酵培養(yǎng)基。

背景技術(shù)

利普斯他汀是由毒三素鏈霉菌(Streptomyces toxytricini)產(chǎn)生的一種具有良好的抑制脂肪酶活性的天然產(chǎn)物，其氫化衍生物奧利司他是目前全球最暢銷的減肥藥物。奧利司他作為一種胃腸道脂肪酶抑制劑，通過與胃和小腸腔內(nèi)的脂肪酶活性絲氨酸部位形成共價鍵結(jié)合，使脂肪酶失活從而不能將食物中的脂肪分解為可吸收的游離脂肪酸和單酰基甘油，從而減少熱量攝入，控制體重增加，達(dá)到控制體重、降糖、降壓、調(diào)脂等目的。奧利司他是唯一通過美國FDA、歐洲EMA、中國NMPA同時批準(zhǔn)治療肥胖癥的非處方藥物，亦是目前唯一經(jīng)NMPA批準(zhǔn)在中國銷售和使用的減肥藥。

目前奧利司他的生產(chǎn)工藝技術(shù)路線有發(fā)酵半合成法和化學(xué)全合成法兩種，化學(xué)全合成路線合成步驟長、反應(yīng)操作較繁、反應(yīng)條件苛刻、分離提純收率低且對環(huán)境污染較大，不符合綠色化工低碳經(jīng)濟的發(fā)展趨勢。目前工業(yè)上主要通過發(fā)酵半合成技術(shù)制備奧利司他，首先通過毒三素鏈霉菌發(fā)酵獲得富含利普斯他汀的發(fā)酵液，然后經(jīng)過分離純化獲得利普斯他汀，再經(jīng)過一步加壓氫化即可高效地得到目標(biāo)成分奧利司他。雖然發(fā)酵半合成的奧利司他需要經(jīng)過發(fā)酵、分離純化、合成等幾個環(huán)節(jié)，技術(shù)路線和過程參數(shù)控制比較復(fù)雜，但與化學(xué)全合成法相比，更加綠色環(huán)保、更加符合清潔生產(chǎn)要求。

自奧利司他作為一種減肥藥物進入臨床以來，以提高利普斯他汀發(fā)酵單位的生物合成機制解析、菌種遺傳選育、發(fā)酵培養(yǎng)基篩選和發(fā)酵過程工藝優(yōu)化工作一直屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域的研發(fā)熱點，至今熱度不退，發(fā)表了數(shù)量眾多的論文。國內(nèi)外有不少有關(guān)利普司他汀發(fā)酵生產(chǎn)的專利報道。美國專利US4598089,US2005089978A1采用了無補料分批發(fā)酵工藝，發(fā)酵單位最高只有1.7～1.8g/L。國際專利W02007134836A1和歐洲專利EP0803576采用了發(fā)酵過程中添加亞油酸、辛酸和亮氨酸等前體以促進利普斯他汀合成的補料分批發(fā)酵工藝，發(fā)酵單位最高3.0～3.2g/L。美國專利US20110014664A1采用了同時流加亞油酸和油酸的補料分批發(fā)酵工藝，并將二者在發(fā)酵液中的殘留濃度控制在合適范圍內(nèi)，利普斯他汀發(fā)酵單位可提高至6g/L以上。中國專利CN103320481B采用了發(fā)酵過程添加亞油酸和亮氨酸前體，并結(jié)合溶氧控制調(diào)控菌株代謝，提高了利普斯他汀的產(chǎn)量，發(fā)酵單位可達(dá)7～8g/L。中國專利CN103555610A通過對發(fā)酵培養(yǎng)基配方配比進行組合優(yōu)化，利普斯他汀發(fā)酵單位提高到約10g/L，但僅停留于搖瓶發(fā)酵階段，未見進一步產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用報道。綜上所述，目前發(fā)酵法生產(chǎn)利普斯他汀仍然面臨以下問題：1)補料分批發(fā)酵過程涉及亞油酸、亮氨酸等前體，前體供應(yīng)不足和前體不平衡問題是利普斯他汀高效生物合成的重要瓶頸，此外外源前體底物對菌體有毒害作用，發(fā)酵液中的前體殘留濃度必須嚴(yán)格控制在適當(dāng)范圍，導(dǎo)致補料發(fā)酵工藝過程種的前體流加策略復(fù)雜難控；2)發(fā)酵過程中亞油酸、亮氨酸前體用量大、價格高，導(dǎo)致發(fā)酵原料成本居高不下；3)無補料分批發(fā)酵工藝單位產(chǎn)量低，無法進入大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用；4)發(fā)酵單位有待繼續(xù)突破和提高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有利普斯他汀發(fā)酵方法中發(fā)酵單位低、發(fā)酵原料成本高、發(fā)酵工藝復(fù)雜難控、不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的問題，提供一種發(fā)酵單位高、發(fā)酵原料成本低、發(fā)酵過程控制簡單方便、無需添加外源毒性前體的適用于工業(yè)化生產(chǎn)的利普斯他汀發(fā)酵方法和發(fā)酵培養(yǎng)基。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種利普斯他汀發(fā)酵方法，包括以下步驟：