[發(fā)明專利]一種細(xì)胞表面脆弱微生物的核酸富集方法及在高通量測序中的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110297714.3
• 申請日: 2021-03-19
• 公開（公告）號: CN113061603A
• 公開（公告）日: 2021-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蓋偉;邊素瑩
• 申請（專利權(quán)）人: 微巖醫(yī)學(xué)科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806;C12Q1/6869;C12Q1/689
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11616
• 代理人: 王光建

本發(fā)明公開了一種細(xì)胞表面脆弱微生物的核酸富集方法，其特征在于，包括如下步驟：步驟S1、檢測受試者樣品中細(xì)胞表面脆弱微生物，步驟S2、樣本制備，步驟S3、微生物DNA進(jìn)行文庫構(gòu)建并進(jìn)行測序，步驟S4、數(shù)據(jù)分析和出具報告。本發(fā)明還公開了所述細(xì)胞表面脆弱微生物的核酸富集方法在高通量測序中的應(yīng)用。本發(fā)明公開的細(xì)胞表面脆弱微生物的核酸富集方法可以選擇性地保護(hù)脆弱微生物的完整性，大大提高了樣本中該類微生物的檢測陽性率，完善了高通量測序方法檢測病原微生物的種類和范圍，提升了通過此類技術(shù)手段輔助診斷的意義；檢測結(jié)果檢測效率高，適用于臨床樣本中脆弱微生物檢測及該類微生物群落研究等領(lǐng)域。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于高通量測序的臨床樣本中細(xì)胞表面脆弱(細(xì)胞壁薄/不穩(wěn)定/無細(xì)胞壁等)微生物核酸富集的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

近年來，隨著二代測序技術(shù)的應(yīng)用，宏基因組病原體測序使高通量、精準(zhǔn)的遺傳學(xué)研究在診斷領(lǐng)域成為可能。但臨床樣本中，病原體相較宿主細(xì)胞含量極微，極大程度降低了病原體檢測靈敏度，因此病原體的富集對臨床樣本中微生物的檢測有重大作用。

目前病原體在提取過程中的富集主要分為提取前富集(Pre-Extraction)和提取后富集(Post-Extraction)兩種形式。提取前富集主要發(fā)生在細(xì)胞層面，通過細(xì)胞水平的差異完成宿主與微生物細(xì)胞分離，去除宿主核酸后獲得微生物細(xì)胞，并通過核酸提取步驟富集微生物核酸；提取后富集主要發(fā)生在核酸層面，細(xì)胞破碎后通過探針法靶向性捕獲微生物核酸，或者通過宿主與微生物核酸甲基化差異，完成富集。

在提取后富集的方式中，通過探針法進(jìn)行提取后富集靶向性范圍小而應(yīng)用受到限制；甲基化差異很難區(qū)分宿主與真核微生物核酸(及部分原核生物核酸)。提取前富集中，需考慮臨床微生物常見病原體細(xì)胞壁表面結(jié)構(gòu)差異較大，存在剛性較強(qiáng)的革蘭氏陽性細(xì)菌(表面肽聚糖層多)及真菌，同時存在細(xì)胞壁薄/不穩(wěn)定的微生物(如支原體、衣原體及部分革蘭氏陰性細(xì)菌等)，后者極易受到宿主細(xì)胞破碎時的干擾而被去除，從而導(dǎo)致本類病原體在測序結(jié)果中的遺漏，貽誤病情判斷。

基于上述背景，本發(fā)明旨在提供一種基于宏基因組學(xué)高通量微生物測序技術(shù)中針對細(xì)胞表面脆弱微生物的富集方式。

本發(fā)明基于高通量測序技術(shù)構(gòu)建了區(qū)分宿主細(xì)胞與細(xì)胞表面脆弱微生物(如支原體、衣原體等)的裂解液配比組合。本發(fā)明可區(qū)分宿主細(xì)胞與該類病原體細(xì)胞表面(如支原體、衣原體等)。基于本發(fā)明的檢測方法，可有效提升高通量測序中這類病原體的檢測靈敏度，提升相關(guān)病原體相關(guān)高通量測序的檢出率。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的在于提供一種細(xì)胞表面脆弱微生物的核酸富集方法及在高通量測序中的應(yīng)用，該方法通過研制新型裂解液配方，在裂解宿主細(xì)胞的同時，可以選擇性地保護(hù)脆弱微生物的完整性，大大提高了樣本中該類微生物的檢測陽性率，完善了高通量測序方法檢測病原微生物的種類和范圍，提升了通過此類技術(shù)手段輔助診斷的意義；檢測結(jié)果檢測效率高，適用于臨床樣本中脆弱微生物檢測及該類微生物群落研究等領(lǐng)域。

為達(dá)到以上目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種細(xì)胞表面脆弱微生物的核酸富集方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟S1、檢測受試者樣品中細(xì)胞表面脆弱微生物：采用檢測受試者樣品中細(xì)胞表面脆弱微生物的高通量測序檢測方法測受試者樣品中細(xì)胞表面脆弱微生物；

步驟S2、樣本制備：選取核酸提取樣本，然后依次進(jìn)行采用裂解試劑對臨床樣本中宿主細(xì)胞裂解、宿主核酸去除、細(xì)胞表面脆弱微生物裂解及核酸提取；其中宿主核酸去除試劑成分為TURBO^TMDNase(2U/μL)1-5μL；細(xì)胞表面脆弱微生物裂解及核酸提取是采用QIAampUCPPathogen Mini Kit或其它具有相似功能的試劑盒完成的；

步驟S3、微生物DNA進(jìn)行文庫構(gòu)建并進(jìn)行測序；

步驟S4、數(shù)據(jù)分析和出具報告。