[發(fā)明專利]一種用于均衡文庫(kù)濃度的文庫(kù)構(gòu)建方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110296224.1
• 申請(qǐng)日: 2021-03-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113061647A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-07-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蓋偉;邊素瑩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 微巖醫(yī)學(xué)科技（北京）有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6806
• 分類號(hào): C12Q1/6806;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11616
• 代理人: 王光建

1.一種用于均衡文庫(kù)濃度的文庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于，包括：核酸片段化及加接頭、文庫(kù)擴(kuò)增環(huán)節(jié)，其特征在于主要通過(guò)文庫(kù)擴(kuò)增環(huán)節(jié)達(dá)到均衡各樣本文庫(kù)的濃度。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于均衡文庫(kù)濃度的文庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于，所述核酸片段化及加接頭的具體操作步驟為：根據(jù)不同測(cè)序平臺(tái)的要求進(jìn)行核酸片段化和加接頭，其中片段化可采用常規(guī)的片段化方法，包括機(jī)械打斷法和酶法打斷法；初始核酸濃度可為0.1pg/μL～100ng/μL；加完接頭的核酸需用1.8×磁珠進(jìn)行純化。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于均衡文庫(kù)濃度的文庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于，所述文庫(kù)擴(kuò)增的具體操作步驟為：擴(kuò)增體系為50μL反應(yīng)體系，按要求依次加入無(wú)核酸酶水、20μL加接頭的產(chǎn)物、10μL 5×Fidelity Buffer、1.5μL dNTPs(10mM)、1.5μL上游引物(10μM)、5μL下游引物磁珠、1μLKAPA HiFi Hotstar DNA聚合酶，混合均勻，置于PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于均衡文庫(kù)濃度的文庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于，所述反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 3min；98℃ 20s→60℃ 15s→72℃ 20s，循環(huán)25-30次，72℃ 1min；所述下游引物磁珠為鏈霉親和素磁珠，其濃度為10mg/mL；磁珠表面結(jié)合有下游引物，所述下游引物通過(guò)生物素與磁珠表面的鏈霉親和素結(jié)合；結(jié)合在磁珠上的引物濃度為0.2pmol/μL。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于均衡文庫(kù)濃度的文庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于，所述下游引物磁珠的制備過(guò)程，包括如下步驟：

步驟S1：取100μL混合均勻的鏈霉親和素磁珠，加入1mL的1×BW緩沖液，混合均勻；

步驟S2：將反應(yīng)管置于磁力架上2min，棄上清；

步驟S3：將反應(yīng)管從磁力架上取下，加入100μL的1×BW緩沖液，重懸磁珠；

步驟S4：重復(fù)步驟2-3兩次，共重復(fù)3次；

步驟S5：將放應(yīng)管置于磁力架上2min，棄上清；

步驟S6：加入200μL 2×BW緩沖液，加入等體積的10μM的下游引物，室溫孵育10min；

步驟S7：將反應(yīng)管置于磁力架上，靜置5min至溶液變澄清，棄上清；

步驟S8：用1×BW緩沖液洗2次；

步驟S9：用1000μL無(wú)核酸酶水重懸磁珠，即得下游引物磁珠。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于均衡文庫(kù)濃度的文庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于，所述2×BW緩沖液組成為：10mM Tris-HCl(pH7.5)，1mM EDTA；2M NaCl；所述1×BW緩沖液為2×BW緩沖液稀釋到原濃度的一半得到；所述下游引物的5'修飾有生物素。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種用于均衡文庫(kù)濃度的文庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于，所述上游引物和下游引物磁珠根據(jù)選擇的建庫(kù)平臺(tái)不同其引物序列不同；若采用Illumina測(cè)序平臺(tái)，則所述上游引物序列為S1：AATGATACGGCGACCACCGAGATCT；所述下游引物磁珠序列為A1-B：Biotin-TTTTT(C3 spacer)TUCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT；若采用Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)，則上游引物序列為S2:CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC；下游引物磁珠序列為A2-B：Biotin-TTTTT(C3 spacer)TUCCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTC。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于均衡文庫(kù)濃度的文庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于，所述下游引物中，Biotin表示生物素標(biāo)記，C3 spcaer為C3修飾，用于終止擴(kuò)增反應(yīng)；所述下游引物中的U堿基，可被USER酶作用，進(jìn)行切除，使合成的雙鏈核酸與鏈霉親和素磁珠分離，用于回收構(gòu)建的文庫(kù)。

9.一種根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述用于均衡文庫(kù)濃度的文庫(kù)構(gòu)建方法的應(yīng)用，其特征在于，包括擴(kuò)增文庫(kù)純化及回收和上機(jī)測(cè)序。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于均衡文庫(kù)濃度的文庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于，所述擴(kuò)增文庫(kù)純化及回收，具體包括如下步驟：

(1)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)管置于磁力架/板上，靜置5～10min至溶液變澄清，棄上清；

(2)向管中加入200μL新鮮配制70％的乙醇，室溫放置1min，棄上清；

(3)重復(fù)上步一次；

(4)將反應(yīng)管置于磁力架/板上，開(kāi)蓋放置3-5min至磁珠干燥；

(5)向其中加入18μL的1X CutSmart buffer，2μL USER酶，混勻后，37℃孵育15min；

(6)將反應(yīng)管置于磁力架上，放置5-10min，至溶液變澄清。

(7)轉(zhuǎn)移上清于一新的離心管中，加入1.8×磁珠進(jìn)行純化，用50μL無(wú)核酸酶水洗脫；

所述上機(jī)測(cè)序，具體為：將制備的文庫(kù)按等體積進(jìn)行混樣，根據(jù)選擇的測(cè)序平臺(tái)的要求，進(jìn)行上機(jī)測(cè)序；并統(tǒng)計(jì)各樣本產(chǎn)出數(shù)據(jù)量；通過(guò)該技術(shù)制備的文庫(kù)各樣本產(chǎn)出數(shù)據(jù)量差異不超過(guò)10％。