[發(fā)明專利]一種重組畢赤酵母基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110294510.4
• 申請日: 2021-03-19
• 公開（公告）號: CN113046256B
• 公開（公告）日: 2023-08-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 應(yīng)漢杰;牛歡青;宋佳睿;閔志迪;陳勇;劉慶國;柳東
• 申請（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12N9/24;C12R1/84
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務(wù)所 32237
• 代理人: 肖明芳

本發(fā)明公開了一種重組畢赤酵母基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，該畢赤酵母基因工程菌是通過在畢赤酵母菌中過表達轉(zhuǎn)錄抑制因子和激活因子HSF1構(gòu)建得到的。所述構(gòu)建方法包括如下步驟：（1）對畢赤酵母菌基因組進行PCR擴增得到HSF1基因片段；（2）將HSF1基因片段克隆到表達質(zhì)粒上，得到重組質(zhì)粒；（3）將線性化的重組質(zhì)粒導(dǎo)入畢赤酵母菌中，篩選得到畢赤酵母基因工程菌。畢赤酵母基因工程菌能夠有效提高自身生物膜成膜能力，使得重組畢赤酵母在單次固定化發(fā)酵條件下產(chǎn)酶的酶活力比游離發(fā)酵的出發(fā)菌提高了28.3％，發(fā)酵周期縮短了36.6%。重組菌能夠穩(wěn)定連續(xù)進行至少七批次的固定化發(fā)酵產(chǎn)酶，經(jīng)過七批次固定化發(fā)酵后，重組菌發(fā)酵產(chǎn)酶的酶活比出發(fā)菌高出約7倍。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程及發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組畢赤酵母基因工程菌及其構(gòu)建方法與在產(chǎn)木聚糖酶中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

木聚糖是植物中半纖維素的主要組成成分，是廣泛存在于自然界中含量極其廣泛的多糖，為世界第二大可再生資源。木聚糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，它的徹底水解需要一系列酶的協(xié)同作用，其中最關(guān)鍵的酶是木聚糖酶。目前所知，細菌、真菌、放線菌、酵母菌、藻類以及動物瘤胃中的細菌等大多數(shù)微生物都能產(chǎn)木聚糖酶。工程菌成為工業(yè)生產(chǎn)木聚糖酶的主要形式，編碼木聚糖酶的基因被克隆到同源或者異源宿主中被高效表達。但當前有許多因素制約其應(yīng)用和發(fā)展，木聚糖酶酶活性和產(chǎn)酶效率成為木聚糖推廣應(yīng)用的制約因素。如何通過基因工程等技術(shù)獲得產(chǎn)酶高，適合工業(yè)應(yīng)用的木聚糖酶是當前亟待解決的問題。

酵母細胞具有顯著的粘附非生物表面、細胞和組織的能力。粘附是由一類特殊的細胞壁蛋白粘附素引起的，細胞攜帶幾種不同的粘附素，每種粘附素都能粘附到特定的基質(zhì)上。不同的酵母種類攜帶不同的粘附素家族，這些粘附素家族反映了該物種的生活方式。例如良性釀酒酵母攜帶五種FLO(絮凝)基因，白色念珠菌攜帶ALS和EAP基因，光滑念珠菌攜帶EPA基因粘附素家族。酵母絮凝是一種可逆的、無性的和鈣依賴性的過程，在這個過程中，細胞粘附形成由數(shù)千個細胞組成的絮狀物。畢赤酵母中的HSF1基因?qū)儆谵D(zhuǎn)錄抑制因子和激活因子，其GO分析的生物進程中包括絮凝功能。酵母生物膜的形成降低了對抗生素藥物的敏感性，增加酵母對于外界環(huán)境的耐受性。

畢赤酵母表達遺傳穩(wěn)定，可對蛋白質(zhì)進行翻譯后加工，表達效率高，產(chǎn)物可分泌至培養(yǎng)基且適于高密度發(fā)酵，因此畢赤酵母表達系統(tǒng)被認為是更適用于工業(yè)化生產(chǎn)的分泌表達系統(tǒng)。然而畢赤酵母生物成膜能力弱、難以進行固定化發(fā)酵的問題亟待解決。目前，關(guān)于畢赤酵母菌中的生物成膜基因及通過生物成膜吸附固定化發(fā)酵的研究鮮有報道。因此，本發(fā)明提供了一種重組畢赤酵母基因工程菌以有效解決上述技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種過表達HSF1基因的重組畢赤酵母基因工程菌。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了一種重組畢赤酵母基因工程菌，由在原始畢赤酵母菌中過表達轉(zhuǎn)錄抑制因子和激活因子HSF1得到。

其中，所述原始畢赤酵母菌為Pichia?Pastoris?GS115。

所述轉(zhuǎn)錄抑制因子和激活因子HSF1的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發(fā)明進一步公開了上述重組畢赤酵母基因工程菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)以畢赤酵母基因組為模板，通過PCR擴增HSF1基因片段；

(2)將步驟(1)獲得的HSF1基因片段克隆到表達質(zhì)粒上，得到重組質(zhì)粒；

(3)將步驟(2)獲得的重組質(zhì)粒線性化后導(dǎo)入原始畢赤酵母菌中，篩選得到重組畢赤酵母基因工程菌。

步驟(1)中，所述的畢赤酵母優(yōu)選為P.Pastoris?GS115。

步驟(1)中，所述PCR擴增所用的引物為引物1和引物2，其核苷酸序列分別如SEQID?NO.2和SEQ?ID?NO.3所示。