[發明專利]一種柔嫩艾美耳球蟲的殼聚糖/納米粒及制備方法

有效

• 申請號: 202110293511.7
• 申請日: 2021-03-19
• 公開（公告）號: CN113041344B
• 公開（公告）日: 2023-07-18
• 發明（設計）人: 李建華;王京森;張西臣;宮鵬濤;張楠;王曉岑;李新;馬赫然;楊舉
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: A61K39/012
• 分類號: A61K39/012;A61K9/51;A61K47/36;A61P33/02;C12N15/867;C12N15/30
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

1.一種殼聚糖/rSFV-Etgam59納米粒疫苗的制備方法，包括以下步驟：

1）重組質粒pSMART2b-Etgam59的構建

設計引物PCR擴增柔嫩艾美耳球蟲Etgam59基因，序列如下：

F：CGCGGATCCGATGACTCGTCTCGCCGCCTG；

R：CCCATCGATTTACTCAAATCCAAAAGAAGGAATGCCCA；

對雞柔嫩艾美耳球蟲配子體的提?。?1日齡雛雞經口感染1×10⁴個孢子化卵囊，感染后132h殺取盲腸，用PBS清洗盲腸漿膜面后剖開腸腹用4℃預冷的SAC溶液沖洗腸道，浸入SAC溶液中于37℃恒溫搖床100rpm消化1.5h，刮取腸粘膜并用60目銅篩，260目網篩，17μm孔徑的濾膜過濾，分別收集濾液；將收集的濾液3500rpm/min離心5min，用PBS沖洗兩次；

配子體的純化：用紅細胞裂解液重懸沉淀，并加入滅菌?PBS?液渦旋震蕩，使其充分混勻；在含配子體的?PBS?液中加入30%?Percoll，同時制備?PBS液與?Percoll?為?1∶1的分離液；在?10?mL滅菌離心管中，分別加入2mL分離液，5?m?L含配子體和30%?Percoll?的PBS液，3200?r?/min?離心15?min，取最下層沉淀物于另一滅菌離心管，用PBS液重懸、3200r/min、5min離心?，用PBS洗滌4次，收集沉淀液氮保存；

提取配子體時期RNA并反轉錄為cDNA，?以雞柔嫩艾美耳球蟲配子體時期cDNA為模板，PCR擴增Etgam59，純化后連接pMD18-T載體并保菌；測序正確后用無縫克隆的方法連接至pSMART2b的BamH1跟Cla1兩個酶切位點，構建重組質粒pSMART2b-Etgam59；

提取無內毒素質粒pSMART2b-Etgam59，按照重組質粒2μg，lip2000?7μl，Opti-MEM?500μl的量制備轉染復合物，轉入細胞培養匯合度60%-80%的293T細胞中，6h后換液，繼續培養24-48h；裂解細胞并獲取細胞蛋白，一抗為雞柔嫩艾美耳球蟲陽性血清，二抗為兔抗雞，進行Western?blot表達鑒定；

2）重組雞球蟲甲病毒顆粒制備

提取無內毒素質粒pSMART2b-Etgam59跟輔助質粒pSHCAR，二者按照1:1的量各1.5μg與lip2000?7μl共轉染至293T細胞，6h后換液繼續培養24-48h，之后收集病毒原液；

將收集的病毒原液激活：加入1/20體積α-糜蛋白酶10g/L以活化病毒，將p62糖蛋白裂解成E2和E3蛋白，室溫孵育30min，然后加入1/15體積的aprotinin抑肽酶10g/L，室溫孵育5min；緊接著將激活后的病毒感染BHk-21細胞2h，然后換液繼續培養24-48h；

3）殼聚糖/rSFV-Etgam59納米粒的制備

制備1%的殼聚糖醋酸溶液CS?0.5mg/ml，PH值調節至4.8；三聚磷酸鈉溶液TPP?0.75mg/ml；將CS溶液在磁懸浮攪拌器中攪拌10min，然后緩慢加入制備好的病毒顆粒，繼續攪拌10min；然后滴加TPP溶液，待溶液由澄清色變為有乳光色沉淀的時候停止滴加，納米粒生成，然后繼續攪拌20min。