[發明專利]一種堆型艾美耳球蟲重組亞單位疫苗及制備方法

在審

• 申請號: 202110293469.9
• 申請日: 2021-03-19
• 公開（公告）號: CN113041343A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 宮鵬濤;畢天奇;張西臣;李建華;張楠;王曉岑;李新;馬赫然;楊舉
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: A61K39/012
• 分類號: A61K39/012;A61P33/02;C12N15/81;C07K14/455
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

本發明涉及一種堆型艾美耳球蟲重組亞單位疫苗及制備方法，根據堆型艾美耳球蟲保護性抗原cSZ1基因序列，利用primer5.0設計引物，擴增cSZ1基因，PCR鑒定正確后回收目的片段，將目的基因與表達載體pPICZαA連接。構建的重組質粒進行PCR和雙酶切鑒定及測序，測序正確的重組質粒進行誘導表達，利用Western bloting進行分析，獲得堆型艾美耳球蟲重組酵母蛋白疫苗；利用酵母作為表達載體的蛋白疫苗的研制具有較好的應用前景，可用于堆型艾美耳球蟲病的預防。

技術領域

本發明涉及一種堆型艾美耳球蟲重組亞單位疫苗及制備方法，用于堆型艾美耳球蟲病的預防，本發明還提供了該疫苗的制備方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

雞球蟲病（coccidiosis）是一種以侵害腸道上皮細胞為特征的寄生原蟲病，分布廣泛，在雛雞中發病率最高，是危害養雞業的主要寄生蟲病之一。目前國際公認危害雞的艾美耳球蟲有7種，即柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella）、堆型艾美耳球蟲（Eimeria acervulina）、巨型艾美耳球蟲（Eimeria maxima）、毒害艾美耳球蟲（Eimeri anecateix）、和緩艾美耳球蟲（Eimeria mitis）、早熟艾美耳球蟲（Eimeria praecox）、和布什艾美耳球蟲（Eimeria brunetti）。其中堆形艾美耳球蟲（Eimeria acervulina）是引起雞球蟲病的重要病原之一，主要發生于較大日齡肉用仔雞和后備母雞，引起雞只的增重受阻和產蛋量下降等問題，嚴重危害養雞業的經濟損失。目前主要防治手段是化學藥物和活蟲苗，但由于長時間使用化學藥物使耐藥性問題凸顯，人們將防治球蟲病的重點轉為免疫預防。因此研制新型高效的抗球蟲疫苗對養雞業的健康發展至關重要。

發明內容

本發明的目的在于提供一種堆型艾美耳球蟲重組亞單位疫苗及制備方法。

本發明的另一目的是提供該堆型艾美耳球蟲重組亞單位疫苗的制備方法。本發明的目的可通過如下技術方案實現:

根據堆型艾美耳球蟲保護性抗原cSZ1基因序列，利用primer5.0設計引物，擴增cSZ1基因，PCR鑒定正確后回收目的片段，將目的基因與表達載體pPICZαA連接。構建的重組質粒進行PCR和雙酶切鑒定及測序，測序正確的重組質粒進行誘導表達，利用 Westernbloting 進行分析，獲得堆型艾美耳球蟲重組酵母蛋白疫苗。

本發明所述的一種堆型艾美耳球蟲重組亞單位疫苗的制備方法，步驟如下：

1、重組酵母蛋白疫苗pPICZαA-cSZ1的制備

首先提取堆型艾美耳球蟲總RNA，并反轉錄為cDNA，通過PCR法擴增cSZ1基因，連接至 pMD18-T，并在 DH5α 克隆，通過測序及酶切鑒定，目的片段大小為522bp。將重組質粒pMD18-T-cSZ1與表達載體pPICZαA同時雙酶切并用 T4 DNA 連接酶連接，轉化至感受態細胞DH5α中，挑取陽性克隆進行PCR檢測、質粒雙酶切和測序，構建重組表達載體pPICZαA-cSZ1，將重組質粒pPICZαA-cSZ1線性化，電轉化至酵母細胞GS115中進行誘導表達，并對表達產物進行Western blot分析鑒定，制備堆型艾美耳球蟲重組酵母蛋白疫苗。

2、疫苗免疫效果檢測