[發(fā)明專利]利用強(qiáng)啟動(dòng)子全合成羥基酪醇的重組解脂亞羅酵母菌的構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110292118.6
• 申請(qǐng)日: 2021-03-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN112980711B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-07-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孟永宏;邱亭媛;郭玉蓉;鄧紅;李封辰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 陜西師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/19
• 分類號(hào): C12N1/19;C12N15/53;C12N15/60;C12N15/81;C12P7/22;C12R1/645
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責(zé)任公司 61201
• 代理人: 高雪霞

本發(fā)明公開(kāi)了一種利用強(qiáng)啟動(dòng)子高效全合成羥基酪醇的重組解脂亞羅酵母菌的構(gòu)建方法，將TYR1、ARO10、ADH和HpaBC目的基因整合至解脂亞羅酵母菌的染色體上，并利用新型強(qiáng)TDH3啟動(dòng)子突變體高效驅(qū)動(dòng)這些外源基因在解脂亞羅酵母菌中特異性表達(dá)，提高了重組表達(dá)效率，進(jìn)而有效提高了重組解脂亞羅酵母菌合成羥基酪醇的能力，提高了羥基酪醇的產(chǎn)量。本發(fā)明重組解脂亞羅酵母菌的構(gòu)建方法操作簡(jiǎn)單，成本低廉，該菌株可以以葡萄糖為底物全合成羥基酪醇，有效解決羥基酪醇產(chǎn)量不足，價(jià)格昂貴的問(wèn)題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于羥基酪醇的合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用強(qiáng)啟動(dòng)子高效全合成羥基酪醇的重組解脂亞羅酵母菌的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

羥基酪醇(hydroxytyrosol，HT)，又名3,4-二羥基苯乙醇，分子式：C₈H₁₀O₃，分子量：154.1632。羥基酪醇是一種主要存在于橄欖中的天然酚類化合物，具有強(qiáng)大的抗氧化活性，可以清除人體內(nèi)自由基，保護(hù)脂質(zhì)免受氧化損傷，具有抗腫瘤、抗炎等功效。此外，羥基酪醇具有良好的生物利用度且不具有已知的毒性。因此，它在食品添加劑、功能食品甚至藥品中都有著巨大的應(yīng)用前景。

目前，羥基酪醇的來(lái)源主要有三個(gè)方面。第一是從橄欖葉及其廢渣中進(jìn)行提取，或從橄欖油或橄欖油廠廢水中萃取，但此法存在產(chǎn)率低、酸性強(qiáng)、產(chǎn)品純度低、生產(chǎn)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。第二是通過(guò)化學(xué)合成法合成羥基酪醇，但化學(xué)試劑普遍具有毒性且較難分離，所以此法存在一定安全風(fēng)險(xiǎn)，環(huán)境污染嚴(yán)重，不適于工業(yè)化生產(chǎn)羥基酪醇。第三是通過(guò)生物合成法合成羥基酪醇，生物合成法具有穩(wěn)定、安全、低污染等優(yōu)勢(shì)，適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，是當(dāng)前熱門(mén)且具有持續(xù)發(fā)展前景的方法。生物合成法包括半合成與全合成，半合成具有路徑簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高的優(yōu)點(diǎn)，但底物價(jià)格偏高，增加了生產(chǎn)成本。

CN104805110A、CN107201331A、CN107723306A、CN107586794A等專利報(bào)道了一些以重組大腸桿菌提高羥基酪醇產(chǎn)量的方法。有的引入外源蛋白，但此法目的蛋白表達(dá)量低，難以提高羥基酪醇的生產(chǎn)效率；有的過(guò)表達(dá)羥基酪醇合成通路的相關(guān)酶，但此法同時(shí)會(huì)增加細(xì)胞代謝的負(fù)擔(dān)，應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)具有很多潛在缺陷。因此，開(kāi)發(fā)能夠高產(chǎn)羥基酪醇，適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的重組菌株，具有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有方法存在的羥基酪醇產(chǎn)率低、生產(chǎn)成本高、污染環(huán)境嚴(yán)重、工藝復(fù)雜、無(wú)法適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)等問(wèn)題，提供一種以葡萄糖為底物，利用強(qiáng)啟動(dòng)子高效全合成羥基酪醇，且操作簡(jiǎn)單的重組解脂亞羅酵母菌的構(gòu)建方法，以期應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，有效解決羥基酪醇產(chǎn)量不足，價(jià)格昂貴的問(wèn)題。

以葡萄糖為碳源，經(jīng)過(guò)糖酵解途徑、莽草酸途徑生成預(yù)苯酸，預(yù)苯酸在預(yù)苯酸脫氫酶(TYR1)的作用下生成對(duì)羥基苯丙酮酸(4-HPP)；再在苯丙酮酸脫羧酶(ARO10)的作用下生成4-羥基苯乙醛(4-HPPA)；再在醇脫氫酶(ADH)的作用下生成酪醇(Tyrosol)；最后在4-羥基苯乙酸-3-單加氧酶(HpaBC)的作用下生成羥基酪醇(HT)。生物合成通路如下所示：

針對(duì)上述目的和生物合成通路，本發(fā)明重組解脂亞羅酵母菌的構(gòu)建方法由下述步驟組成：

1、構(gòu)建質(zhì)粒pJN44-TYR1’-ARO10’-ADH’-HpaBC’

合成含有TDH3啟動(dòng)子突變體P’_TDH3的預(yù)苯酸脫氫酶基因TYR1表達(dá)盒P’_TDH3-TYR1-Ter、苯丙酮酸脫羧酶基因ARO10表達(dá)盒P’_TDH3-ARO10-Ter、醇脫氫酶基因ADH表達(dá)盒P’_TDH3-ADH-Ter、4-羥基苯乙酸-3-單加氧酶基因HpaBC表達(dá)盒P’_TDH3-HpaBC-Ter，將這四個(gè)表達(dá)盒依次連接至pJN44載體上，形成表達(dá)質(zhì)粒pJN44-TYR1’-ARO10’-ADH’-HpaBC’。