[發明專利]基于熒光定量PCR技術定量檢測大腸桿菌O157:H7的方法

在審

• 申請號: 202110291647.4
• 申請日: 2021-03-18
• 公開（公告）號: CN113201585A
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 彭雙;王一明;宋丹;周貝貝;魏翠蘭
• 申請（專利權）人: 江蘇開放大學（江蘇城市職業學院）
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/689;C12Q1/10;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 曹翠珍

本發明提供基于熒光定量PCR技術定量檢測大腸桿菌O157:H7的方法，該方法包括：(1)提取樣本的微生物基因組DNA；(2)將所述基因組DNA放入PCR反應管中，并向管中加入正向引物、反向引物、SYBR Green Reaction Mix、ROX和無菌水，對標準對照液和待測樣品同時進行PCR擴增和熔解曲線測定，獲得大腸桿菌O157:H7實時定量PCR的Ct值，根據標準對照液的Ct值和拷貝數擬合的標準曲線，即可定量檢測大腸桿菌O157:H7。本發明穩定性良好、靈敏度高、特異性強，與土壤和糞便中的其他細菌無交叉反應，能夠在1.5小時之內對土壤和畜禽糞便中大腸桿菌O157:H7進行定量檢測。

技術領域

本發明屬于大腸桿菌定量檢測技術領域，具體涉及基于熒光定量PCR技術定量檢測大腸桿菌O157:H7的方法。

背景技術

大腸桿菌O157(Escherichia coli O157)是與食源性爆發相關的最常見的病原菌之一。植物生長的土壤是病原菌潛在的污染來源，糞便中存活的腸道病原菌在它們進入土壤環境后可進一步污染作物和河道，從而增加胃腸道疾病的潛在傳播風險。大腸桿菌O157能夠在施用糞肥的土壤中長期生存。據報道，大腸桿菌O157:H7在21℃條件下可在土壤中存活200天以上，最高可存活長達600天。即使是在含水量較低的土壤中，腸出血型大腸桿菌也能存活數月之久。一些大腸桿菌可以在河岸土壤以及河流底泥中生長，大腸桿菌O157:H7甚至可以吸收利用土壤中的可溶性物質。病原菌污染作物的潛力，與其在環境中的存活能力有直接的關系，如果病原菌能夠存活至作物收獲期，則可能通過被污染的作物傳播到消費者體內。因此，應對糞便中殘留病原菌在土壤中的存活時間和濃度、及其向地表和地下水資源遷移的風險給予充分的關注。

近年來，隨著生物技術的快速發展，新技術新方法在食品微生物檢驗領域得到了廣泛應用，大腸桿菌O157:H7的檢測方法也越來越多，但是這些方法大部分并不適用于微生物多樣性非常高的土壤樣品和糞便樣品，而且檢測時間也較長，定量檢測難度較大。因此建立適用于土壤和糞便樣品的，快速且靈敏的大腸桿菌O157:H7的定量檢測方法十分重要，對畜禽糞肥在農業生態系統的合理施用，農業系統大腸桿菌O157:H7污染的預防及控制均具有重要的意義。

發明內容

為了克服現有技術中大腸桿菌O157:H7的檢測效果不佳的缺陷，本發明提供基于熒光定量PCR技術定量檢測大腸桿菌O157:H7的方法，根據大腸桿菌O157:H7的β-葡萄糖醛酸酶基因組(β-glucuronidase gene)序列設計，特異性強，擴增大腸桿菌O157:H7的準確度高，穩定性好，可有效解決土壤和糞便中大腸桿菌O157:H7定量檢測的問題。

作為本發明的一方面，本發明提供一種用于熒光定量PCR技術定量檢測大腸桿菌O157:H7的方法，其包括以下步驟，(1)提取樣本的微生物基因組DNA；(2)將所述基因組DNA放入PCR反應管中，并向管中加入正向引物、反向引物、SYBR Green Reaction Mix、ROX和無菌水，對標準對照液和待測樣品同時進行PCR擴增和熔解曲線測定，獲得大腸桿菌O157:H7實時定量PCR的Ct值，根據標準對照液的Ct值和拷貝數擬合的標準曲線，即可定量檢測大腸桿菌O157:H7，其中所述正向引物的序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的序列如SEQID NO.2所示。

優選的，所述正向引物和所述反向引物的用量比為1:1。

優選的，所述進行PCR擴增，其反應條件為，預變性：95℃3min；變性：95℃20秒；退火：53-63℃30秒；延伸：72℃30秒，采集熒光信號；重復變性至延伸的步驟，總共40個循環。

優選的，所述熔解曲線測定，其為在所述延伸步驟后進行，測定條件為65℃升溫至95℃，每隔0.5℃收集熒光信號。

優選的，最低檢測DNA濃度為1.5×10^-4ng/μL。