[發(fā)明專利]一種促進(jìn)體細(xì)胞重編程的方法

有效

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• 申請日: 2021-03-18
• 公開（公告）號: CN112941019B
• 公開（公告）日: 2023-01-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 祝賽勇;王衛(wèi)云
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;C12N5/074;C12N15/867
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 傅朝棟;張法高

本發(fā)明公開了一種促進(jìn)體細(xì)胞重編程的方法，即通過外源添加或內(nèi)源調(diào)控的方法來提高體細(xì)胞中H₂S的生成，進(jìn)而促進(jìn)體細(xì)胞的重編程。其中，外源添加為化學(xué)誘導(dǎo)方法，即在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加N?乙酰?L?半胱氨酸，得到重編程培養(yǎng)基；利用重編程培養(yǎng)基培養(yǎng)重編程早期階段的體細(xì)胞；通過提高體細(xì)胞內(nèi)H₂S的產(chǎn)生，最終促進(jìn)了體細(xì)胞的重編程。內(nèi)源調(diào)控為基因過表達(dá)方法，即將待重編程的體細(xì)胞轉(zhuǎn)染基因過表達(dá)病毒，使體細(xì)胞過表達(dá)Cbs基因；通過提高體細(xì)胞內(nèi)H₂S的產(chǎn)生，最終促進(jìn)了體細(xì)胞的重編程。本發(fā)明的方法可以顯著提高體細(xì)胞重編程的效率，促進(jìn)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)的應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于體細(xì)胞重編程領(lǐng)域，具體涉及一種促進(jìn)體細(xì)胞重編程的方法。

背景技術(shù)

干細(xì)胞目前可以通過以下幾種方式獲得：

1)從囊胚中分離。胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells，ESCs)來源于胚胎發(fā)育囊胚時期的內(nèi)細(xì)胞團，具有多能性，并且可以無限增殖，是研究自我更新、發(fā)育和疾病的有力工具。但胚胎干細(xì)胞的獲取涉及倫理問題，并且在進(jìn)行臨床應(yīng)用時存在免疫排斥問題。

2)核移植。將體細(xì)胞的細(xì)胞核移植到去核卵母細(xì)胞中，可消除體細(xì)胞特征并有發(fā)育為完整個體的潛能。但該技術(shù)操作困難，并且也涉及到倫理問題。

3)細(xì)胞融合。將體細(xì)胞和干細(xì)胞融合得到的雜交細(xì)胞可消除體細(xì)胞特征，獲得多能細(xì)胞的生化和發(fā)育特性。可用于研究遺傳互補和尋找使體細(xì)胞發(fā)生重編程的因子。但該方法得到的細(xì)胞不是正常染色體細(xì)胞，不能用于臨床應(yīng)用。

4)轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)的體細(xì)胞重編程。重編程是指通過一定的手段使已經(jīng)分化的細(xì)胞恢復(fù)到具有分化能力的干細(xì)胞的狀態(tài)。體細(xì)胞中轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)錄因子(Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc)使體細(xì)胞發(fā)生重編程從而誘導(dǎo)產(chǎn)生多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)。該方法得到的細(xì)胞可來源于患者本身，因此在臨床應(yīng)用時不會發(fā)生免疫排斥，并且不涉及倫理問題。但在重編程過程中細(xì)胞的基因組整合了外源基因，臨床應(yīng)用有成瘤的風(fēng)險。

5)小分子誘導(dǎo)的體細(xì)胞重編程(化學(xué)重編程)。體細(xì)胞培養(yǎng)時加入小分子化合物，將體細(xì)胞誘導(dǎo)為多能干細(xì)胞。這種方法得到的干細(xì)胞可來源于患者本身的體細(xì)胞，排除免疫排斥和倫理問題；并且沒有外源基因的插入，臨床應(yīng)用更加安全。但該方法目前效率低、耗時久并且分子機制尚不明確，限制了干細(xì)胞的臨床應(yīng)用。

因此尋找新的小分子來提高重編程效率、揭示其中的機制，對iPSCs的臨床應(yīng)用非常有必要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，并提供一種促進(jìn)體細(xì)胞重編程的方法。

本發(fā)明所采用的具體技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種促進(jìn)體細(xì)胞重編程的方法，即通過外源添加或內(nèi)源調(diào)控的方法來提高體細(xì)胞中H₂S的生成，進(jìn)而促進(jìn)體細(xì)胞的重編程(記為方案A)。

作為優(yōu)選，所述體細(xì)胞為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(記為方案B)。

作為方案A或B的優(yōu)選，所述外源添加為化學(xué)誘導(dǎo)方法。

進(jìn)一步的，所述化學(xué)誘導(dǎo)方法如下：

將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加N-乙酰-L-半胱氨酸，得到重編程培養(yǎng)基；利用重編程培養(yǎng)基培養(yǎng)重編程早期階段的細(xì)胞；通過提高體細(xì)胞內(nèi)H₂S的產(chǎn)生，從而調(diào)控了線粒體氧化磷酸化活性和細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)，最終促進(jìn)了體細(xì)胞的重編程。

更進(jìn)一步的，所述重編程培養(yǎng)基中N-乙酰-L-半胱氨酸的濃度為5mM。

更進(jìn)一步的，所述N-乙酰-L-半胱氨酸的初始濃度為1M，N-乙酰-L-半胱氨酸與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的混合比例為1:200。