[發(fā)明專利]小分子化合物提高基因敲除和堿基編輯系統(tǒng)活性的方法及其應(yīng)用方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110290336.6
• 申請日: 2021-03-18
• 公開（公告）號: CN113215193B
• 公開（公告）日: 2023-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 谷峰;趙天源
• 申請（專利權(quán)）人: 溫州醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85
• 代理公司: 杭州斯可睿專利事務(wù)所有限公司 33241
• 代理人: 鄭書利

本發(fā)明涉及一種小分子化合物Rocilinostat或Nexturastat?A提高基因敲除和堿基編輯系統(tǒng)活性的方法，使用基因編輯系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯時(shí)，加入小分子化合物Rocilinostat或Nexturastat?A處理細(xì)胞，Rocilinostat或Nexturastat?A提高基因編輯系統(tǒng)中基因敲除和堿基編輯系統(tǒng)活性。以獲得更高的基因編輯效率，解決在精確位點(diǎn)特異性基因編輯的低活性的問題，有助于臨床腫瘤治療靶標(biāo)的篩選，藥物開發(fā)，致病突變糾正、動(dòng)物模型制備等研究。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，涉及一種提高基因敲除和堿基編輯系統(tǒng)活性的方法及其應(yīng)用方法。

背景技術(shù)

基因編輯技術(shù)是指使用核酸酶直接對DNA序列進(jìn)行編輯，從而實(shí)現(xiàn)特定DNA片段的敲除、插入/缺失或替換等。目前，對基因編輯工具的開發(fā)和改造一直是21世紀(jì)生命科學(xué)領(lǐng)域科學(xué)家們的研究重點(diǎn)，新型的基因編輯工具層出不窮。規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(Clustered?regulatory?interspaced?short?palindromic?repeats，CRISPR)/CRISPR相關(guān)蛋白9(CRISPR-associated?Protien?9，Cas9)是繼鋅指核酸酶(zinc?finger?nuclease，ZFN)和轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(transcription?activator-like?effectornucleases，TALEN)技術(shù)之后的新一代基因改造工具，此CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)，利用單鏈的向?qū)NA(single-guide?RNA,sgRNA)引導(dǎo)有核酸酶切割活性的Cas9蛋白對特定靶點(diǎn)進(jìn)行切割，實(shí)現(xiàn)基因敲除和定點(diǎn)修飾。

胞嘧啶堿基編輯器(CBE)是一種可以進(jìn)行單個(gè)堿基C到T編輯的新型基因編輯工具，主要由具有催化功能的胞嘧啶脫氨酶和CRISPR/Cas9融合而成。其中胞嘧啶脫氨酶根據(jù)來源不同，分為以下幾種：大鼠來源的rAPOBEC1(rat?apolipoprotein?B?mRNA-editingenzyme?catalytic?polypeptide-like?protein)，七鰓鰻來源的激活誘導(dǎo)性胞嘧啶脫氨酶(activationinducedcytidinedeaminase，AID)類似物(PmCDA1)[6]，人源的AID(hAID)，人源的APOBEC3A。早期的堿基編輯系統(tǒng)使用的CRISPR/Cas9是無核酸酶活性的dCas9，不對靶序列產(chǎn)生切割，現(xiàn)在常用的是有單鏈DNA切口酶活性的nCas9(D10A)，只對其中一條DNA產(chǎn)生切割而形成切口，這兩種Cas9都保留有與單鏈引導(dǎo)RNA(single?guide?RNA，sgRNA)結(jié)合的能力，Cas9和sgRNA一起介導(dǎo)胞嘧啶脫氨酶在特定的靶序列產(chǎn)生堿基的轉(zhuǎn)換。近期，又報(bào)道了一種可以實(shí)現(xiàn)腺嘌呤A到鳥嘌呤G的新型腺嘌呤堿基編輯工具腺嘌呤堿基編輯器(ABE)。

CBE和ABE系統(tǒng)在進(jìn)行堿基的編輯時(shí)，無需產(chǎn)生DSB，從而避免了細(xì)胞內(nèi)非同源末端連接(non-homologous?end-joining，NHEJ)修復(fù)造成的隨機(jī)插入/缺失(Insert/Deletion，Indel)，實(shí)現(xiàn)了更加安全的基因編輯，可以應(yīng)用于人類細(xì)胞的編輯、基因突變動(dòng)物模型的構(gòu)建、作物的改良、小鼠胚胎的治療等領(lǐng)域。

但現(xiàn)有基因敲除和堿基編輯系統(tǒng)效率的低下，存在在精確位點(diǎn)特異性基因編輯的低活性的問題。因此，提高基因敲除和堿基編輯系統(tǒng)的基因編輯活性，有助于實(shí)現(xiàn)目的基因的高精度編輯，能擴(kuò)展基因編輯工具在基因治療和動(dòng)物育種等領(lǐng)域的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種小分子化合物Ricolinostat(Rocilinostat或ACY-1215)或Nexturastat?A提高基因敲除和堿基編輯系統(tǒng)活性的方法的方法及其應(yīng)用方法，該方法提高基因敲除和堿基編輯系統(tǒng)活性，獲得更高的基因編輯效率，解決在精確位點(diǎn)特異性基因編輯的低活性的問題，有助于臨床腫瘤治療靶標(biāo)的篩選，藥物開發(fā)，致病突變糾正、動(dòng)物模型制備等研究。