[發明專利]表面活化的熒光乳膠微球的制備方法及應用

在審

• 申請號: 202110289748.8
• 申請日: 2021-03-16
• 公開（公告）號: CN113150352A
• 公開（公告）日: 2021-07-23
• 發明（設計）人: 宋孟杰;劉照關
• 申請（專利權）人: 蘇州為度生物技術有限公司
• 主分類號: C08J7/12
• 分類號: C08J7/12;G01N21/64;G01N33/543;C08L25/06;C08L33/12;C08L33/14
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 楊慧林

本發明涉及一種表面活化的熒光乳膠微球的制備方法，包括以下步驟：將表面修飾羥基的熒光乳膠微球分散，加入催化劑，攪拌至溶解，加入環氧氯丙烷并攪拌；加入堿并攪拌，清洗，得到表面活化的熒光乳膠微球。本發明通過對羥基改性得到表面有環氧基團修飾的熒光乳膠微球，此表面活化的微球可一步結合抗體，簡化了偶聯工藝，在抗體偶聯中顯示出較高的反應活性。

技術領域

本發明涉及高分子材料技術領域，尤其涉及一種表面活化的熒光乳膠微球的制備方法及應用。

背景技術

乳膠微球是由高聚合材料合成的納米級球形的標記材料，根據表面官能團的不同可分為羧基化、氨基化、巰基化乳膠微球，還可以包裹不同顏色染料，使其顏色豐富，可滿足多種實驗的要求。因其穩定性問題，在使用之前，微球表面是未經活化的，沒有吸附或化學膠連能力，使用時必須先經活化處理，熒光乳膠微球才能借助于微球表面豐富的功能基團(如羧基、氨基等)與抗體或者抗原共價結合，進而捕獲相應的待測物，之后通過熒光信號的強弱實現相應生物分子的定量檢測。

微球與抗原/抗體共價結合常采用的偶聯方法為EDC/NHS法。首先使用水溶性的碳二亞胺EDC對微球上的羧基官能團進行活化生成活性酯中間體，該活性酯中間體可直接與含氨基的生物分子高效結合，從而將生物分子偶聯到微球表面。但由EDC反應形成的活性酯中間體穩定性較差，容易水解，可通過引入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)形成另一更穩定的活性酯中間體，與氨基發生取代反應形成酰胺鍵，較大提高生物分子的結合效率。但在活化偶聯工藝中，活化完成后需要對試劑進行洗脫處理，大致流程為活化、離心、洗滌、分散、加入蛋白結合、配成試劑，這個過程中還是存在很多不穩定的情況，如微球團聚、活化效果差、偶聯效率低，如何更高效穩定地進行微球和生物分子的結合成為乳膠微球生物應用中亟待解決的關鍵問題。

CN1246351C公開了一種環氧功能型交聯核殼結構納米高分子微球，在乳化劑和引發劑存在的條件下通過以水為介質的乳液或懸浮聚合得到了具有核殼結構、納米尺度、表面帶有環氧官能團的高分子微球；CN103386282B采用帶環氧基的硅烷偶聯劑得到表面環氧基活化的磁性微球，但構建方式均較為復雜。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明通過對羥基改性得到表面有環氧基團修飾的熒光乳膠微球，此表面活化的微球可一步結合抗體，簡化了偶聯工藝，因此避免了傳統活化偶聯工藝中出現的微球團聚、活化效果差和偶聯效率低的問題。

本發明的一種表面活化的熒光乳膠微球的制備方法，包括以下步驟：

(1)將表面修飾羥基的熒光乳膠微球分散，加入催化劑，攪拌至溶解，加入環氧氯丙烷并攪拌；

(2)向步驟(1)的混合溶液中加入堿并攪拌，清洗，得到表面活化的熒光乳膠微球。

本發明在催化劑作用下，環氧氯丙烷上的環氧基與微球表面的羥基反應開環，使開環后的環氧氯丙烷接枝到羥基微球表面，之后在堿性條件下脫氯化氫、閉環，得到環氧基表面的微球。環氧基活化的微球與生物分子的共價連接不需要其他活化劑的加入，同時，兩步反應提高了微球表面羥基的反應效率，保證后續環氧基團的高得率。兩步反應如下所示：

進一步地，表面修飾羥基的熒光乳膠微球、催化劑、環氧氯丙烷和堿的質量比為1:0.01-0.1:0.1-10:0.1-10。

進一步地，環氧氯丙烷和堿的質量比為1:1-1.1。此質量比的目的是，經閉環得到的環氧基不會在過高堿溶液存在下發生堿性開環，從而保證環氧基的得率。

進一步地，在步驟(1)中，熒光乳膠微球選自含有熒光的聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球和聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球中的一種或多種，尺寸為100-1000nm。

進一步地，在步驟(1)中，催化劑為Lewis酸。

進一步地，Lewis酸選自三氯化鋁、三氟化硼或三氟甲烷磺酸中的一種或多種。