[發明專利]一種基于CRISPR/Cas12a點切割可視化檢測植原體的方法

在審

• 申請號: 202110288664.2
• 申請日: 2021-03-17
• 公開（公告）號: CN113046450A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 李繼東;馮建燦;陳鵬;李奇乘;楊琦琪;葉霞;鄭先波;譚彬
• 申請（專利權）人: 河南農業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京華際知識產權代理有限公司 11676
• 代理人: 袁瑞紅

本發明公開了一種基于CRISPR/Cas12a點切割可視化檢測植原體的方法，該方法通過設計針對植原體16SrDNA序列保守區域的crRNA，激活CRISPR/Cas12a的蛋白的切口功能實現對linker?arm DNA的切割，以產生所需要的斷裂DNA片段，并利用納米金顯色技術成功檢測出多種植原體，這對實現植原體田間快速可視化檢測具有重大意義。本發明具有成本低，操作簡便，效率高，靈敏度高和特異性強等特性，并且通過顯色即可肉眼判斷，顯色反應效果持久明顯。減少了對實驗室大型儀器和精密信號采集儀器的依賴，為植原體的檢測提供了新思路和新選擇。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及采用生物學的方法對植原體進行檢測，更具體涉及一種基于CRISPR/Cas12a點切割可視化檢測植原體的方法。

背景技術

植原體(phytoplasma)是一種專性寄生于植物韌皮部篩管細胞的類菌原體。在世界范圍內引起上千種植物的病害發生。植物感染植原體后，表現出叢枝、小葉簇生、植株矮化、花器官畸形及花變葉等異常發育表型，嚴重時整株枯死。由于植原體專性寄生在植物韌皮部篩管細胞，由于生長條件苛刻無法離體培養，植原體病害目前仍缺乏有效的治療手段。植物一旦感染植原體，很難挽回損失，在缺乏有效治療手段的背景下，植原體的檢測是防治植原體病害的關鍵環節。因此建立起簡便，靈敏，快速和準確的植原體檢測體系對防治植原體病害具有重要意義。

在缺乏有效治療手段的背景下，植原體的檢測是防治植原體病害的關鍵環節。隨著分子生物學技術的發展，植原體的檢測技術發展迅速。目前植原體的檢測手段主要包括電子顯微鏡檢測，組織化學法檢測，血清學檢測，分子生物學檢測等方法。電子顯微鏡法和血清法結果準確可信，但是操作復雜且對樣本質量要求高。組織化學法成本低廉，操作簡便但準確性和靈敏性較低。分子生物學檢測是目前植原體檢測中最為常用的檢測手段。具有靈敏性高，結果準確等優點。但是無法脫離實驗室大型設備且檢測時間較長。因此建立起靈敏，準確，快速的田間檢測方法是未來植原體檢測領域的研究方向。近年來，CRISPR/Cas系統作為一種基因工程中非常重要的工具被廣泛應用于基因編輯、基因表達調控及基因檢測等研究中。最近的進展表明，CRISPR相關(Cas)內切核酸酶系統，如Cas12a、Cas13a和Cas14，均具有可用于核酸檢測的特征(Chen et al，2018；Gootenberg et al.，2017；Harringtonet al.，2018)。而CRISPR/Cas12a系統可以作為識別切割DNA片段的理想手段，當Cas12a/crRNA/靶DNA三元復合物形成時，Cas12a具有DNA激活的一般DNase活性，可以非特異切割任何DNA片段(Chen et al.，2018；Li et al.，2018)。

發明內容

針對現狀，本發明提供一種基于CRISPR/Cas12a點切割可視化檢測植原體的方法，旨在解決傳統植原體檢測中成本高、對實驗室設備高度依賴性、要求檢測人員具有較深的專業知識等問題，使植原體的田間可視化檢測成為可能。

本發明的目的之一在于提供一種識別植原體16SrDNA序列保守區域的crRNA。

本發明的目的之二在于提供用于等溫擴增植原體16SrDNA片段的RPA引物。

本發明的目的之三在于提供用于CRSPR/Cas12a切割體系的linker-arm DNA。

本發明的目的之四在于提供一種通過納米金顯色原理檢測植原體的方法。

為實現上述目的，本發明采取如下技術方案：

一種基于CRISPR/Cas12a點切割可視化檢測植原體的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)設計合成crRNA的引物序列，制備針對植原體16SrDNA序列保守區域的crRNA；