[發明專利]一種煙草法尼基焦磷酸合酶基因及其應用

有效

• 申請號: 202110287865.0
• 申請日: 2021-03-17
• 公開（公告）號: CN112980809B
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 曾婉俐;李雪梅;向海英;高茜;陰耕云;蔣佳芮;許力;鄧樂樂;李晶;米其利;王晉;陳千思
• 申請（專利權）人: 云南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/82;A01H6/82;A01H5/12
• 代理公司: 北京維澳專利代理有限公司 11252
• 代理人: 王立民

1.一種降低煙草葉片中植物甾醇含量的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、以煙草葉片的cDNA為模板，進行PCR擴增獲得NtFDPS基因，核苷酸序列如SEQ?IDNO.1所示，PCR擴增用引物序列如下：

NtFDPS-F：5’-?ATGTATTTGGTACTTGCAACAAG?-?3’，

NtFDPS-R：5’-?CACCATCACATATACCAGCC?-?3’；

S2、構建重組TRV2-?NtFDPS載體，將步驟S1中的PCR擴增產物及空載體TRV2進行EcoRI、BamHI雙酶切，利用T4?DNA連接酶進行連接，將連接產物轉化大腸桿菌感受態DH5α，轉化操作結束后將轉化產物涂布在含50mg/L?Kan的LB固體培養基上，37℃過夜培養，挑選陽性單菌落擴增后進一步進行PCR鑒定，?并結合測序驗證，確保獲得構建正確的重組載體TRV2-?NtFDPS；

S3、利用農桿菌介導的VIGS技術，將所構建的重組載體TRV2-?NtFDPS轉化煙草植株；將TRV2-NtFDPS的陽性克隆質粒，通過電擊轉化方式轉化進入農桿菌GV3101感受態細胞中，利用含50mg/L?Kan?和50mg/L?Rif的YEB平板進行培養篩選，在28℃倒置培養2d后，利用菌落PCR篩選帶有目的基因的農桿菌。

2.根據權利要求1的方法，其特征在于，通過qRT-PCR對NtFDPS基因表達情況進行檢測，在TRV2-?NtFDPS的侵染植株中，NtFDPS的表達量顯著降低，qRT-PCR引物如下：

NtFDPS-F：5’-?CTCCTACTCTGAAAGAAACGAACA?-?3’，

NtFDPS-R：5’-?CGAGCCTCATCAGTAAACTCG-?3’。