[發明專利]一種將體外富集的PBMC擴增活化CD8+T細胞群的方法

在審

• 申請號: 202110287550.6
• 申請日: 2021-03-17
• 公開（公告）號: CN113005084A
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 靳飛虎;李偉;趙鵬
• 申請（專利權）人: 山西懷瑾基業生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 太原九得專利代理事務所(普通合伙) 14117
• 代理人: 高璇

1.一種將體外富集的PBMC擴增活化CD8+T細胞群的方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)從外周血中獲取PBMC；

2)采用無血清培養基將PBMC的密度調整為0.9×10⁶cells/ml～1.4×10⁶cells/ml，吹打均勻，接種到預包被細胞接種瓶中；

3)然后向預包被細胞接種瓶中加入IFN-γ，至預包被細胞接種瓶中IFN-γ的濃度為1000U/ml，同時按體積比加入10％的滅活自體血清；

擴增第0天，將預包被細胞接種瓶放入培養箱中誘導刺激24h，所述培養箱中的溫度為37℃，CO₂的濃度為7.5％；

擴增第1天，向預包被細胞接種瓶中加入IL-2，至預包被細胞接種瓶中IL-2的濃度為700U/ml，在溫度為37℃、CO₂濃度為5％的條件下繼續培養；

擴增第4天，T細胞異質群擴增開始，加入新鮮X-VIVO15無血清培養基，同時加入IL-2和NaHCO₃，至預包被細胞接種瓶中IL-2的濃度為1000U/ml、NaHCO₃的濃度為1.97g/ml；維持預包被細胞接種瓶中的PH值為7.35～7.45；

4)活化CD8+T細胞群。

2.根據權利要求1所述的一種將體外富集的PBMC擴增活化CD8+T細胞群的方法，其特征在于：

所述活化CD8+T細胞群的方法包括以下步驟：

擴增第7天，T細胞大量分裂增值，進入對數生長期，向預包被細胞接種瓶中加入地西他濱，至預包被細胞接種瓶中地西他濱的濃度為10umol/L，繼續培養5天，期間補充加入培養基和地西他濱，維持預包被細胞接種瓶中地西他濱的濃度為10umol/L。

3.根據權利要求1所述的一種將體外富集的PBMC擴增活化CD8+T細胞群的方法，其特征在于：所述從外周血中獲取PBMC的方法包括以下步驟：

1)采集60～80ml外周血；將采集的外周血均分至2個50ml的離心管中，以2000rmp的速度離心10min，得到上層血漿和下層血細胞；

2)將上層血漿采集到50ml的離心管中，在溫度為56℃的條件下水浴處理30min進行滅活；然后以3000rmp的速度離心10min；收集上清液A，將其置于溫度為4℃的條件下保存；將沉淀物舍棄；所述上清液A即為滅活自體血清；

3)取步驟1)中得到的下層血細胞，按照下層血細胞：生理鹽水為1：2的比例配制45ml，吹打均勻；

然后雞尾酒式的方法加入到3個盛有15mlFicoll液的50ml離心管中，以2000rmp的速度離心20min；得到上清液B和白膜層；

將上清液B舍棄，吸取白膜層的PBMC于50ml離心管中，以1600rmp的速度離心8min，收集離心管底部細胞；

將離心管底部細胞用PBS溶液洗滌1次；然后以1200rmp的速度離心8min；再次收集離心管底部細胞；將再次收集的離心管底部細胞用PBS溶液洗滌2次；即可獲得PBMC。

4.根據權利要求1所述的一種將體外富集的PBMC擴增活化CD8+T細胞群的方法，其特征在于：所述預包被細胞接種瓶的制備方法包括以下步驟：

向T175培養瓶中加入包被液10ml；

輕輕搖晃使包被液鋪滿培養瓶瓶底；

將培養瓶用錫紙包裹起來，在溫度為4℃的條件下放置24h，然后去除包被液；

加入10ml不含Ca²⁺、Mg²⁺離子的PBS溶液洗滌瓶底兩次即可。

5.根據權利要求4所述的一種將體外富集的PBMC擴增活化CD8+T細胞群的方法，其特征在于：所述預包被細胞接種瓶的制備方法中，所述包被液為濃度為0.5ug/ml的OKT3抗體和濃度為25ug/ml的重組纖維鏈接蛋白的PBS溶液。