[發明專利]一株分泌醚菌酯單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應用

有效

• 申請號: 202110286531.1
• 申請日: 2021-03-17
• 公開（公告）號: CN112779225B
• 公開（公告）日: 2022-10-18
• 發明（設計）人: 胥傳來;林璐;匡華;徐麗廣;馬偉;劉麗強;吳曉玲;宋珊珊;胡擁明
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/44;C07K14/795;C07K14/77;C07C251/60;C07C249/04;G01N33/577;G01N33/53;C12R1/91
• 代理公司: 無錫華源專利商標事務所(普通合伙) 32228
• 代理人: 嚴梅芳

一株分泌醚菌酯單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應用，屬于食品安全免疫檢測領域。本發明分泌醚菌酯單克隆抗體的雜交瘤細胞株AE，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，分類命名為單克隆細胞株，保藏日期2020年4月23日，保藏編號CGMCC No.19680。將醚菌酯的完全抗原免疫BALB/c小鼠，將高效價、低IC₅₀小鼠的脾細胞，通過PEG方法與小鼠骨髓瘤細胞融合，采用選擇培養基，篩選出兩種細胞融合后的雜交細胞；再經間接競爭酶聯免疫法篩選細胞并三次亞克隆，最終得到一株雜交瘤細胞株AE。AE分泌的單克隆抗體，對醚菌酯具有較好的特異性和檢測靈敏度(IC₅₀值為0.5ng/mL)，為食品中醚菌酯殘留的免疫檢測提供了原料，具有實際應用價值。

技術領域

本發明涉及一株分泌醚菌酯單克隆抗體雜交瘤細胞株及其應用，屬于食品安全免疫檢測領域。

背景技術

醚菌酯(kresoxim-methyl)又稱(E)-2-甲氧亞氨基-[2-(鄰甲基苯氧基甲基)苯基]乙酸甲酯，是一種高效、廣譜、新型甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑。對草莓白粉病、甜瓜白粉病、黃瓜白粉病、梨黑星病、葡萄白腐病等病害具有良好的防效。它能控制治療子囊菌綱、擔子菌綱、半知菌綱、卵菌綱等大多數病害。對孢子萌發及葉內菌絲體的生長有很強的抑制作用，具有保護、治療和鏟除活性。有很好的滲透性及局部內吸活性，持效期長，被廣泛用于防治果樹類、蔬菜類、茶樹、煙草等作物上的病害。由于醚菌酯具有高效廣譜的殺菌活性，可一次性或多次用于蔬菜、果樹及禾谷類作物；若亂用、濫用或使用不當，藥物可能通過食物鏈傳遞到人群，對人體的健康產生潛在風險。

因此，《GB 2763—2019食品中農藥最大殘留限量》中規定了醚菌酯在各種食品中的最大殘留限量標準(MRL)，如其在糙米中的MRL為0.1mg/kg，在黃瓜中的MRL為0.5mg/kg，在蘋果和梨中的MRL均為0.2mg/kg，在葡萄干中的MRL為2mg/kg，以及在草莓中的MRL為1mg/kg。

為了有效監督監測醚菌酯的使用情況，防止藥物的不規范使用，有必要開發一種高靈敏度、高特異性的檢測方法，而目前檢測方法如高效液相色譜法、高效液相色譜串聯質譜法等儀器檢測方法，其樣品前處理過程極為復雜、成本昂貴，并且儀器方法并不適用于現場檢測。免疫學檢測方法是一種低成本、快速且高靈敏度高特異性的檢測方法，而且操作簡便、成本低，已廣泛適用于藥物殘留檢測領域。建立高效的免疫學檢測方法，篩選高特異性的單克隆抗體是其重要前提。

發明內容

本發明的目的是在于提供一株醚菌酯單克隆抗體雜交瘤細胞株，由該細胞株制備的抗體對醚菌酯具有較高的檢測靈敏度，可以用來建立醚菌酯的免疫學檢測方法。

本發明的技術方案，一株分泌醚菌酯單克隆抗體雜交瘤細胞株AE，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，分類命名為單克隆細胞株，保藏日期2020年4月23日，保藏編號CGMCC No.19680。

醚菌酯單克隆抗體，其由所述保藏編號為CGMCC No.19680的雜交瘤細胞株AE分泌產生。

醚菌酯半抗原，結構簡式如下：

醚菌酯半抗原的制備方法：稱取2-(2-甲基苯氧甲基)苯甲酰甲酸甲酯，溶于甲醇、水和吡啶的混合溶液中，加入羧甲基羥胺半鹽酸鹽，水浴持續攪拌反應后，取出，室溫條件下避光過夜；隨后，氮吹，加入三氯甲烷溶解，再加入純水萃取三次，除去上層水相后，下層有機相經氮氣吹干后，得到醚菌酯半抗原。