[發(fā)明專利]一種布魯氏菌外膜囊泡的制備方法及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110284943.1
• 申請日: 2021-03-17
• 公開（公告）號: CN113025640B
• 公開（公告）日: 2023-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 賀筍;何傳雨;李劼;潘毅平;吳冬玲;趙海龍;劉夢志;李明奇;師偉偉
• 申請（專利權(quán)）人: 天康生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/31;C12N1/21;A61K39/10;A61P31/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 王煥

本發(fā)明提供了一種布魯氏菌外膜囊泡的制備方法及其應用，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。所述方法包括以基因OMP39、BamD、OMP2b、Cgs、BF3285c中的一種或多種為靶標進行改造獲得基因缺失突變株的步驟。本發(fā)明通過基因工程方法，選擇潛在的基因靶標位點進行改造，成功獲得5株基因缺失菌株，進行菌株培養(yǎng)提取外膜囊泡的結(jié)果顯示改造后的菌株外膜囊泡產(chǎn)量得到顯著提高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種布魯氏菌外膜囊泡的制備方法及其應用。

背景技術(shù)

布魯氏菌病是一種重要的人畜共患傳染病，人感染后出現(xiàn)發(fā)熱、肌肉酸疼等癥狀，之后逐步喪失勞動力。動物感染后主要引起繁殖障礙。總之，布魯氏菌病會對社會和經(jīng)濟發(fā)展造成重大的影響。過去的幾十年中，通過疫苗免疫和防控宣傳，使大家對布魯氏菌病有了更充分的了解，但要更一步的提高防控效果以及根除布魯氏菌仍有更多的工作要做，最主要的是研發(fā)安全有效的疫苗，當前使用的疫苗主要為減毒活疫苗，在疫苗的使用過程中對人和動物存在感染的風險，成為疫苗推廣使用的主要痛點。

革蘭氏陰性菌的外膜囊泡(Outer?membrane?vesicles，OMVs)具有雙層膜，由脂蛋白、外膜蛋白(OMP)、脂多糖(LPS)和一些周質(zhì)成分組成，含有菌體必須的免疫原性蛋白，同時含有大量的病原相關(guān)模式分子(PAMP)，能有效誘導機體的非特異性免疫。因此，外膜囊泡可用于研發(fā)布魯氏菌疫苗或者用于增強免疫性。然而，由布魯氏菌正常分泌產(chǎn)生的外膜囊泡的量相對較少，因此，有必要提供一種能夠提高布魯氏菌外膜囊泡產(chǎn)量的制備方法。

鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種布魯氏菌外膜囊泡的制備方法及其應用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的布魯氏菌外膜囊泡產(chǎn)量不高的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下：

在一方面，本發(fā)明提供了一種布魯氏菌外膜囊泡的制備方法，所述方法包括以基因BamD、OMP39、OMP2b、Cgs、BF3285c中的一種或多種為靶標進行改造獲得基因缺失突變株的步驟。

本發(fā)明提供的外膜囊泡制備方法，通過基因工程方法選擇細胞膜穩(wěn)定性相關(guān)的基因靶標位點進行改造，成功獲得5株基因缺失菌株，利用所述基因缺失突變株提取外膜囊泡，3株顯著提高了菌株外膜囊泡產(chǎn)量。

在一個實施方案中，所述改造獲得基因缺失突變株采用同源重組的方法進行；優(yōu)選地，所述同源重組為自殺性質(zhì)粒介導的同源重組。

在一個實施方案中，所述改造獲得基因缺失突變株包括以下步驟：

(a)擴增待敲除基因的上下游同源臂；

(b)將擴增產(chǎn)物DNA片段分別連接果糖蔗糖酶基因SacB，然后構(gòu)建自殺性質(zhì)粒；

(c)將所述自殺性質(zhì)粒加入布魯氏菌感受態(tài)細胞中并進行轉(zhuǎn)化；

(d)篩選陽性克隆株。

在一個實施方案中，所述自殺性質(zhì)粒為pBK-CMV-ΔBamD-SacB、pBK-CMV-ΔOMP39-SacB、pBK-CMV-Δomp2b-SacB、pBK-CMV-Δcgs-SacB、pBK-CMV-ΔBF3285c-SacB。

在一個實施方案中，當所述待敲除基因為BamD時，擴增上游同源臂序列的引物序列如SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示；擴增下游同源臂序列的引物序列如SEQ?ID?NO.3和SEQ?ID?NO.4所示；

當所述待敲除基因為OMP39時，擴增上游同源臂序列的引物序列如SEQ?ID?NO.5和SEQ?ID?NO.6所示；擴增下游同源臂序列的引物序列如SEQ?ID?NO.7和SEQ?ID?NO.8所示；