[發明專利]一步轉化標記藍藻染色體的方法和應用

在審

• 申請號: 202110284596.2
• 申請日: 2021-03-17
• 公開（公告）號: CN113046382A
• 公開（公告）日: 2021-06-29
• 發明（設計）人: 鄭正高;劉軼群;董春霞;趙進東
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N15/65;C12N15/90
• 代理公司: 北京萬象新悅知識產權代理有限公司 11360
• 代理人: 李稚婷

1.一種藍藻染色體的標記方法，包括以下步驟：

1)構建TetO序列重復n次形成的TetO序列陣列TetO×n，在每兩個TetO序列之間插入10～30nt的隨機堿基序列R1、R2、……、Rn，其中n為正整數，n≥60；

2)設計構建具有核心元件Upstream—P₁—TetR-GFP—TetO×n—S—Downstream的染色體標記載體，其中：Upstream和Downstream代表將所述核心元件通過同源雙交換連入藍藻染色體基因某個位點的上下游同源片段；P₁代表啟動子；TetR-GFP是四環素操縱子中抑制蛋白TetR與綠色熒光蛋白的融合蛋白；TetO×n是TetO序列重復n次形成的TetO序列陣列，S代表選擇標記基因；

3)將染色體標記載體轉入藍藻中，然后在有選擇壓力的平板培養基上連續劃線傳代陽性克隆，篩選純合陽性菌株；

4)取陽性純合菌株檢測其綠色熒光，即可觀測到藍藻染色體的熒光亮點。

2.如權利要求1所述的標記方法，其特征在于，所述TetO序列為5’-tctctatcactgataggga-3’，在步驟1)構建TetO序列陣列TetO×120，其序列如序列表中SEQID No:2所示。

3.如權利要求1所述的標記方法，其特征在于，步驟2)中所述啟動子P₁為誘導型啟動子或組成型啟動子。

4.如權利要求3所述的標記方法，其特征在于，所述啟動子P₁選自Cu²⁺誘導的啟動子PpetE、Fe³⁺誘導的啟動子PisiAB、Zn²⁺誘導的啟動子Psmt。

5.如權利要求1所述的標記方法，其特征在于，在步驟2)中，對于絲狀體藍藻Upstream和Downstream的長度為3Kb，對于單細胞藍藻Upstream和Downstream的長度為1Kb。

6.如權利要求1所述的標記方法，其特征在于，步驟2)中所述選擇標記基因為抗性標記基因。

7.如權利要求1所述的標記方法，其特征在于，所述抗性標記基因是紅霉素抗性基因Em、卡那霉素抗性基因Kan、新霉素抗性基因Neo或鏈霉素抗性基因Sm。

8.如權利要求1所述的標記方法，其特征在于，在步驟3)中，通過自然轉化的方法將所述染色體標記載體轉入單細胞藍藻中，或者通過三親交配遺傳轉化方法將所述染色體標記載體轉入絲狀體藍藻中。

9.如權利要求1所述的標記方法，其特征在于，所述藍藻為魚腥藻Anabaena sp.PCC7120，構建具有核心元件Upstream—PpetE—TetR-GFP—TetO×120—Em—Downstream的染色體標記載體277ARY，然后將染色體標記載體277ARY通過三親交配遺傳轉化進入魚腥藻Anabaena sp.PCC 7120中，接著在紅霉素抗性板上連續劃線傳代陽性克隆，篩選純合陽性菌株ARY，檢測其綠色熒光，即可觀測到藍藻染色體的熒光亮點。

10.權利要求1～9任一所述的藍藻染色體的標記方法在研究藍藻染色體復制和分離機制中的應用。