[發明專利]一種卵母細胞體外成熟培養液的制備方法

有效

• 申請號: 202110283271.2
• 申請日: 2021-03-17
• 公開（公告）號: CN113025564B
• 公開（公告）日: 2023-05-02
• 發明（設計）人: 包云;余柯達;柴娟;毛佳婷;師帥
• 申請（專利權）人: 金華市人民醫院
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 杭州云睿專利代理事務所(普通合伙) 33254
• 代理人: 張驍敏

本發明公開了一種卵母細胞體外成熟培養液的制備方法，包括以下步驟：(1)用PBS制備200mmol/L的肌肽溶液；(2)將步驟(1)中的肌肽溶液加入IVM未成熟卵培養液中，形成體外成熟培養液；(3)將步驟(2)所得的體外成熟培養液通過20?25μm的濾膜進行過濾，最終得卵母細胞體外成熟培養液。肌肽能夠有效促進未成熟卵母細胞的體外成熟及提高卵母細胞的質量。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種卵母細胞體外成熟培養液的制備方法。

背景技術

卵母細胞體外成熟技術(in?vitro?maturation,IVM)是一項新的輔助生育技術，不經超促排卵或少量應用促性腺激素后從卵巢中獲取未成熟卵，在體外經過適宜的條件進行成熟培養，使卵子成熟并具備受精能力。卵母細胞IVM技術不但能充分利用體外受精/胞漿內單精子注射(in?vitro?fertilization?/intracytoplasmic?sperm?injection,IVF/ICSI)周期中的未成熟卵母細胞，而且能降低促性腺激素對卵巢的過度刺激，減少卵巢過度刺激綜合征的發生，還能為年輕女性癌癥患者提供生育保險，具有很好的發展前景。IVM作為一種有效治療手段可應用于治療多囊卵巢綜合征、卵巢高反應及低反應患者、癌癥患者生育力保存等,該技術已在全世界應用并有數千名健康嬰兒出生。但IVM中卵母細胞的成熟率仍然較低，報道在40％-70％之間，受精率也不高，形成的胚胎發育潛能差，這些都是IVM妊娠成功率較常規IVF-ET技術低的重要原因。因此如何提高卵母細胞的體外成熟率及受精率，改善胚胎的發育潛能，成為困擾生殖醫學界的大難題。

肌肽(carnosine)是由β-丙氨酸和L-組氨酸組成的天然二肽化合物，在哺乳動物體內廣泛分布，如腦，骨骼肌，肝臟，腎臟等，濃度高達5-20mM。肌肽具有多種生物學功能，比如：抗氧化，抗糖基化，抗炎癥，螯合金屬離子，調節PH值。研究發現，肌肽對于阿茲海默癥、帕金森綜合癥、高血壓、糖尿病和腦中風均有治療效果。近年來，研究發現肌肽還具有抗腫瘤的作用，目前報道過的有胃腺癌、人惡性膠質瘤、結腸癌、乳腺癌等。目前尚未有研究證明肌肽是否能改善卵母細胞體外成熟的結局。

發明內容

本申請提供一種卵母細胞體外成熟培養液的制備方法，可以得到肌肽能改善卵母細胞體外成熟的結局。

本發明的技術是這樣實現的：

一種卵母細胞體外成熟培養液的制備方法，包括以下步驟：

(1)用PBS制備200mmol/L的肌肽溶液；

(2)將步驟(1)中的肌肽溶液加入IVM未成熟卵培養液中，形成體外成熟培養液；

(3)將步驟(2)所得的體外成熟培養液通過20-25μm的濾膜進行過濾，最終得卵母細胞體外成熟培養液。

進一步設置，步驟(2)中所述體外成熟培養液中肌肽濃度為30～200μ?mol/L。

進一步設置，所述體外成熟培養液中肌肽濃度為100μmol/L。

進一步設置，步驟(2)中所述IVM未成熟卵培養液的基礎培養液為ɑ?-MEM培養液，含有5％胎牛血清、3ng/mL表皮生長因子、50mIU/mL重組卵泡刺激素、0.25mmol/L丙酮酸鈉、0.5％青霉素、0.5％鏈霉素。

進一步設置，步驟(3)所述用濾膜孔徑為22μm。

本發明的有益效果：肌肽能夠有效促進小鼠未成熟卵母細胞的體外成熟及提高卵母細胞的質量，作用機制是通過降低ROS水平，提高抗氧化能力，改善線粒體的分布來提高卵母細胞質量的。因此，肌肽可以在制備促進卵母細胞成熟及提高卵母細胞發育潛能的藥物、制備培養液中應用。

附圖說明

圖1為挑選可用小鼠卵母細胞和卵母細胞體外成熟情況；

圖2為兩組卵母細胞的ROS水平；