[發明專利]一種同時對多種HPV亞型進行檢測的方法和試劑盒

在審

• 申請號: 202110282325.3
• 申請日: 2021-03-16
• 公開（公告）號: CN112899403A
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發明（設計）人: 周巍;何沛中;汪旭;許國強
• 申請（專利權）人: 生捷科技（杭州）有限公司;生捷科技（嘉興）有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6837;C12N15/11
• 代理公司: 北京市漢坤律師事務所 11602
• 代理人: 雷娟;吳麗麗

本公開提供了一種同時對多種HPV亞型進行檢測的方法，所述方法包括以下步驟：(1)任選的預擴增步驟：利用隨機引物來預擴增待測樣品中的核酸物質；(2)擴增步驟：利用保守引物對來擴增包含特異性區域的片段；(3)雜交步驟：使通過步驟(2)產生的擴增產物與基因芯片雜交；(4)檢測步驟：基于所述擴增產物與基因芯片的雜交結果，檢測HPV亞型。本公開還提供了一種同時對多種HPV亞型進行檢測的試劑盒，所述試劑盒包含基因芯片和如SEQ ID NO:1?17所示的保守引物對。

技術領域

本公開提供了一種HPV基因分型檢測方法，以及HPV基因分型檢測試劑盒。

背景技術

宮頸癌是全球女性第二大惡性腫瘤。全世界每年約有53萬新發病例，約有31.1萬人死于宮頸癌，其中大部分發生在發展中國家。在我國，宮頸癌的發病率和死亡率僅次于乳腺癌，每年新發病例數約為13萬例且逐年提升，死亡約為3萬例。已有研究表明高危型人乳頭瘤病毒(Human Papilloma virus，HPV)是宮頸癌發病的主要原因。目前，宮頸癌是唯一病因明確、可以預防的腫瘤疾病。

HPV的基因組為雙鏈環狀DNA分子，包含約7200-8000個堿基對。根據基因序列功能，HPV基因組可分為3個區域，分別是長控制區(LCR)、早期轉錄區(E區)和晚期轉錄區(L區)。LCR區含有基因組的復制起點和表達所需的調控元件，參與調控病毒的轉錄與復制；E區包括E1-E7，負責編碼病毒相關蛋白；L區包括L1和L2，編碼病毒的主要衣殼蛋白(L1)和次要衣殼蛋白(L2)，L1約占衣殼蛋白的80％，序列高度保守，L2含量較少，變異較多。HPV依據DNA的同源性進行分型，目前已經鑒定出的HPV亞型有200多種。HPV可感染多種組織和器官，已經鑒定出HPV亞型中約有40余種亞型可感染生殖道上皮粘膜，根據致病性不同，HPV可分為低危型和高危型。低危型如HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44等；HPV16、HPV18、HPV31、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68等為高危型大約有19種，其中HPV16和HPV18被認為致病性最強，是宮頸癌的主要致病亞型。

約80％的女性在一生中至少會感染一次HPV，低危型HPV主要導致濕疣類病變，而長期持續性感染高危HPV與宮頸癌變有著密切的關系。由于HPV可在體內潛伏10年甚至更長時間，且不出現任何臨床癥狀，人們很容易忽略HPV檢測，這就導致了宮頸癌前病變發展到宮頸癌的過程極為漫長。在臨床上將HPV檢測納入常規篩查，通過早期篩查提高HPV早期檢出率，可以提高宮頸癌前病變的治愈率，最終預防宮頸癌的發生，降低宮頸癌的發病率。因此，HPV檢測及分型在宮頸癌篩查、早期預防、臨床診斷及后期治療等方面具有十分重要的價值。

目前HPV檢測方法主要分為非分子水平檢測方法和分子水平檢測方法，非分子水平檢測方法主要有：醋酸白試驗、陰道鏡檢測、宮頸刮片細胞學檢查、宮頸和宮頸管活組織檢查，這些方法受取材、涂片制作、閱讀技術影響，準確率低、假陽性高、重復性差、漏診率可達30％。分子水平檢測方法主要有斑點印跡法、分子導流雜交法、飛行時間質譜法、熒光原位雜交法、Southern雜交法、PCR和雜交捕獲法等。斑點印跡法具有放射性，危害檢測人員的身體健康。熒光原位雜交法操作流程復雜，對檢測人員要求較高。傳統PCR檢測方法假陽性較高。雜交捕獲法試劑盒雖然無需進行PCR即可區分高危型與低危型，但是無法判斷具體基因型。Sanger終止法準確度高，但一次只能讀取單個基因的序列，不具備高通量特性。

目前市面上的HPV檢測產品種類多，大多采用PCR熒光或雜交與其他技術結合的方式，但不同技術間的結合還存在靈敏度、背景、效率的問題，難以對HPV進行準確分型。

發明內容

本公開可以提供一種同時對多種HPV亞型進行檢測的方法，該方法包括以下步驟：

(1)任選的預擴增步驟：利用隨機引物來預擴增待測樣品中的核酸物質；

(2)擴增步驟：利用保守引物對來擴增包含特異性區域的片段；