[發明專利]一種耐熱性β-甘露聚糖酶突變體ManAK-7及其編碼基因和應用

有效

• 申請號: 202110280056.7
• 申請日: 2020-05-18
• 公開（公告）號: CN112877310B
• 公開（公告）日: 2022-02-11
• 發明（設計）人: 牟海津;劉哲民;苑明雪;張芳
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N9/24
• 分類號: C12N9/24;C12N15/56;C12N15/81;C12N1/19;A23K20/189;C12R1/84
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 梁正賢

本發明涉及一種耐熱性β?甘露聚糖酶突變體ManAK?7及其編碼基因和應用，屬于基因工程和酶工程領域，所述突變體是在野生β?甘露聚糖酶ManAK的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示基礎上進行的突變，所述的突變位點選自G331C、S158Y、Q166W、S177R、S180I、K99W、N178R、N178I、D273C/V308C或N277C/T315C中的一種。本發明突變體的耐熱穩定性提高，且基本保持了野生β?甘露聚糖酶ManAK的廣泛pH和最適溫度。

技術領域

本發明屬于基因工程和酶工程領域，特別涉及一種耐熱性提高的β-甘露聚糖酶突變體ManAK-7及其編碼基因和應用。

背景技術

甘露聚糖是植物半纖維素的主要成分，廣泛存在于自然界中，它是多種植物細胞壁的主要組成成分，作為植物性飼料原料被視為一種抗營養因子。由于甘露聚糖的多樣性與結構的復雜性，它的完全水解需要多種酶的協同作用才能完成，包括內切-β-甘露聚糖酶、外切-β-甘露糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、乙酞甘露聚糖酯酶和α-半乳糖苷酶等。其中，內切-β-甘露聚糖酶能夠降解甘露聚糖主鏈的β-1，4-糖苷鍵，是甘露聚糖降解過程中發揮最重要作用的酶。

β-甘露聚糖酶(β-mannanase,EC 3.2.1.78)主要來源于細菌、真菌和放線菌等微生物，目前，應用于工業生產β-甘露聚糖酶的菌種多為曲霉、芽抱桿菌、酵母等，在食品、醫藥、飼料等領域有廣泛的應用。β-甘露聚糖酶在飼料工業中作為一種飼料添加劑，能有效地降解飼料中的甘露聚糖，提高動物對飼料的消化能力。目前飼料添加劑用酶都需要經過高溫制粒，制備能夠耐高溫、耐酸、具有對消化酶耐受性提高的β-甘露聚糖酶，對于β-甘露聚糖酶在飼用酶和工業化應用具有重要價值。野生型的β-甘露聚糖酶基因經過異源表達和理性設計后已經能夠獲得較好的酶學性質，對于提高現有的β-甘露聚糖酶的耐高溫性能發揮著至關重要的作用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種耐熱性提高的β-甘露聚糖酶突變體，在飼料及其他領域具有更為良好的應用潛力。

具體而言，本發明針對前期開發的耐熱酸性β-甘露聚糖酶ManAK進行必要的理性設計，改良酶學特性。ManAK最適反應pH為2，且當pH在2.0-6.0范圍內具有較好的穩定性。最適作用溫度為75℃，在60℃高溫下30min可保持83％的酶活。然而，作為飼料添加劑應用，其耐熱性和酶活力還有待進一步提高。

為了提高ManAK耐熱性能，本發明對該酶的空間結構進行分子模擬對接分析，通過分析分子內二硫鍵，將該酶進行單位點和雙位點突變，得到的突變體的最適溫度(T_opt)和t_1/2都有改變，耐熱性能提高。

一種耐熱性β-甘露聚糖酶突變體，是在野生β-甘露聚糖酶ManAK的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示基礎上進行的突變，所述的突變位點選自G331C、S158Y、Q166W、S177R、S180I、K99W、N178R、N178I、D273C/V308C或N277C/T315 C中的一種。

本發明的再一目的是提供編碼上述突變體的基因。

本發明的再一目的是提供包含上述突變體基因的重組載體。

本發明的再一目的是提供包含上述突變體基因的重組菌株，所述重組菌株為畢赤酵母X33。

本發明還提供所述突變體在飼料或飼料添加劑中的應用。

本發明還提供含有所述突變體的飼料或飼料添加劑。

本發明還提供所述重組菌株在飼料或飼料添加劑中的應用。

本發明還提供所述重組載體在飼料或飼料添加劑中的應用。

根據本發明的技術方案，野生β-甘露聚糖酶ManAK的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

SEQ ID NO.1：