[發明專利]一種新型B族鏈球菌核酸PCR-膠體金免疫層析法檢測試劑盒

在審

• 申請號: 202110276766.2
• 申請日: 2021-03-15
• 公開（公告）號: CN113025733A
• 公開（公告）日: 2021-06-25
• 發明（設計）人: 于超計;吳文立;王倩玉;趙立明
• 申請（專利權）人: 北京華瑞康源生物科技發展有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6804;C12Q1/14;C12R1/46
• 代理公司: 北京紐樂康知識產權代理事務所(普通合伙) 11210
• 代理人: 劉艷艷

本發明公開了一種新型B族鏈球菌核酸PCR?膠體金免疫層析法檢測試劑盒，該試劑盒包括擴增反應MIX、GBS檢測液、陽性對照品、陰性對照品和樣本釋放劑；所述GBS檢測液包括針對B族鏈球菌CAMP基因的特異性標記引物、內參基因RNAse P的特異性標記引物和RNase Free ddH₂O。本發明的新型B族鏈球菌核酸PCR?膠體金免疫層析法檢測試劑盒通過對采集的細胞樣本經提取核酸后，在Taq DNA聚合酶的作用下，擴增出特異性片段，再利用膠體金免疫層析法實現B族鏈球菌核酸檢測，另外，在樣本的采集、核酸提取和PCR擴增過程中有內參基因RNAse P進行質控跟蹤，保證全部實驗過程均在可控范圍內。

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，具體來說，涉及一種新型B族鏈球菌核酸PCR-膠體金免疫層析法檢測試劑盒。

背景技術

B族鏈球菌是一種革蘭氏陽性球菌，學名無乳鏈球菌(S.agalactiae)，早期被獸醫界重視是由于它能引起牛乳房炎，嚴重危害畜牧業。直至1938年，Fry首次報告3例人類感染B族鏈球菌引起產后心內膜炎的死亡，證實B族鏈球菌也是人類的致病菌。由于該菌細胞壁中多糖物質屬于抗原構造分類中的B族，故又被稱為B族鏈球菌(Group B Streptococcus，GBS)。

B族鏈球菌是一種條件致病菌，是國際上公認的新生兒侵襲性感染的首要原因。如果孕婦感染B族鏈球菌，新生兒就可能在出生時吸入感染的羊水或通過產道時感染B族鏈球菌。新生兒感染B族鏈球菌主要表現為早期侵入性感染，以新生兒敗血癥為主要臨床表現。新生兒感染B族鏈球菌能夠導致敗血癥，肺炎和腦膜炎，發病率和死亡率較高，也可能遺留長期病理狀態如耳聾、視力受損、發育障礙以及腦癱等。同時，B族鏈球菌還可引起早產、胎兒發育不良(低體重兒)、胎膜早破及晚期流產。美國新哈芬地區歷經10年的調查統計結果顯示：新生兒敗血癥年發生率為2.7‰，其中約50％是B族鏈球菌感染引起的。抗生素(尤其是青霉素)是治療B族鏈球菌感染的有效手段，因此為避免抗生素濫用、同時又有效降低新生兒GBS感染，在孕婦產前進行B族鏈球菌感染篩檢顯得尤為必要。

為降低由于B族鏈球菌感染導致的新生兒感染，中華醫學會婦產科學分會產科學組在《孕前和孕期保健指南建議》(2018版)中明確將GBS篩查作為高危孕婦的備查項目，且最佳檢測時間在35～37周。因此，建立有效快捷的孕產婦GBS篩查方法，對于降低新生兒GBS感染具有重要意義。

目前B族鏈球菌感染的實驗室檢測方案主要包括傳統的培養法和熒光定量PCR法。培養法作為病原微生物檢測的金標準，具有特異性高的顯著優勢，但卻具有耗時長、費用大、培養難度高、通量低、靈敏度低等一系列缺點，很難滿足臨床實際需求；熒光定量PCR法具有靈敏度高、耗時短、通量相對較高的優勢，但其檢測過程依賴于昂貴的qPCR儀器，又很難滿足基層醫院的需求。

核酸膠體金免疫層析技術是將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在NC膜上形成檢測線(T線)、內參線(R線)和質控線(C線)，膠體金標記試劑(抗體或單克隆抗體)吸附在結合墊上。待測樣本通過常規的核酸提取后，采用5’端帶有特定標記的引物進行PCR擴增，之后將擴增產物直接添加到試紙條一端的樣本墊上后，擴增產物通過毛細作用向前移動，在結合墊上與膠體金標記試劑相互作用，當移動至固定的抗原或抗體的區域時，待檢物與金標試劑的結合物又與之發生特異性結合而被截留，聚集在檢測帶上，形成肉眼可觀察的顯色結果(如圖1所示)。該方法已廣泛應用于抗原抗體檢測，但在核酸檢測領域還鮮有使用。

在整個實驗過程中，需要經過樣本核酸提取和PCR擴增，可能會出現污染或其他干擾因素，而傳統膠體金只有兩條檢測線，無法設置內參基因檢測，不能有效監控整個核酸檢測過程，可能造成假陰性結果，干擾判斷。

本發明旨在建立一種利用PCR技術和膠體金免疫層析技術的能夠簡便、快速、準確、高通量檢測35～37周孕婦GBS感染情況的試劑盒。該試劑盒內有內參基因進行全程質控，可以避免假陰性結果干擾。

發明內容